【摘要】：1.研究背景阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD),又稱老年性癡呆,屬于中樞神經系統(tǒng)退行性疾病,以學習功能出現(xiàn)障礙及記憶力逐漸減退為主要臨床表現(xiàn),在老年群體中屬于常見病和多發(fā)病,其發(fā)病率較其他疾病而言相對較高,而且發(fā)病率與年齡之間存在著密切的聯(lián)系,其發(fā)病率隨著年齡的增大而增加。根據國際阿爾茨海默病協(xié)會(ADI)發(fā)布的報告顯示,目前世界上患AD的人數(shù)約為4700萬人,預計到21世紀50年代的時候,全球AD患者的人數(shù)將會是現(xiàn)有患者人數(shù)的兩倍多,約為1.135億,如此龐大的患者群體將會給世界各國帶來沉重的經濟負擔和社會負擔,因此,AD受到世界醫(yī)學界的高度重視,已經成為現(xiàn)在醫(yī)學界亟待攻克的難題,但是AD的發(fā)病機制非常復雜,每種發(fā)病機制不是單一存在的,而且各種發(fā)病機制相互交織,相互影響,共同導致AD的發(fā)生,隨著近幾年對AD研究的逐步深入,單一機制尚不能完全解釋AD的發(fā)生。越來越多的學者認為炎性反應是AD發(fā)病的主要機制,在AD的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用,在AD患者腦內,炎性反應存在于疾病的各個階段。本課題組前期的研究證實:“通督啟神”針法具有治療AD的作用,其可能作用機制是抑制了小膠質細胞的活化,減少了炎性介質的釋放,從而降低了炎性介質對大腦的損害。小膠質細胞的活化及其相關炎癥介質的釋放與AD的發(fā)生、發(fā)展密切相關,本研究以此為切入點,分別采用脈沖電針和音樂電針對模型小鼠進行治療,運用Morris水迷宮、免疫組化及Western blot技術,從活體到病理組織等不同層面來觀察模型小鼠海馬小膠質細胞活化后產生的炎癥因子的變化以及行為學變化,來探析“通督啟神”法不同電針治療AD的科學內涵及其可能作用機制,為該病的臨床治療探索新的方案,并提供科學合理的實驗證據。2.研究目的本研究通過采用“通督啟神”法不同電針來治療7月齡APP/PS1雙轉基因AD模型小鼠,運用Morris水迷宮觀察模型小鼠的空間學習能力和和空間記憶能力的變化,并運用分子生物學方法來檢測海馬內相關炎性因子COX-2、TGF-β1的表達水平的變化,來探析在“通督啟神”法理論的指導下不同電針治療AD的可能作用機制,并比較音樂電針與脈沖電針治療AD的療效差異。3.研究方法分組:本實驗將40只SPF級雄性APPswe/PS1dE9雙轉基因小鼠隨機分為模型組、藥物組、脈沖電針組和音樂電針組,每組10只,另外,10只相同月齡和相同遺傳背景的C57BL/6雄性小鼠作為正常對照組,體重為24.6±4.3g。干預方法:正常對照組:相同飼養(yǎng)條件下不進行任何治療,在其他各組治療時將其抓入自制的鼠套內,20min后拆開鼠套將其放入鼠籠內,以確保干預條件與其他組相一致,每天抓取1次,共15天。模型組:處理方法與正常對照組相同。藥物組:選用鹽酸多奈哌齊灌胃給藥治療,劑量為0.92mg/kg,用藥前將藥物粉碎成粉末,然后用蒸餾水溶解,每天治療1次,連續(xù)治療15天,在其他組接受治療時,將其抓入自制鼠套內,20min后拆開鼠套放回鼠籠中,以確保干預條件與其他組相一致。脈沖電針組:治療時將其抓入自制鼠套內固定,然后對其進行治療,所選穴位為“通督啟神”法針灸協(xié)定處方,即百會穴、印堂穴和人中穴,所選針具為中研太和牌一次性無菌針灸針,針刺人中穴時,采用的是點刺法,不留針,百會穴和印堂穴均向后上方平刺,針刺深度約為0.5cm,然后用韓式電針儀的兩極分別連接兩針的針柄,波形選用疏密波,輸出的頻率大小為2～50Hz,每天治療1次,每次20min,連續(xù)治療15天。音樂電針組:針刺方法同脈沖電針組,針柄連接ZJ-12H音樂電針治療儀,選用抗癡呆音樂處方,每天治療1次,每次20min,連續(xù)治療15天。檢測方法和指標:15天治療完畢后,采用Morris水迷宮定位航行實驗檢測小鼠的空間學習能力,采用Morris水迷宮空間探索實驗檢測小鼠的空間記憶能力,采用免疫組織化學方法檢測小鼠海馬COX-2、TGF-β1的表達情況,采用Western blot方法檢測小鼠海馬COX-2、TGF-β1蛋白的相對表達量。4.研究結果4.1 Morris水迷宮實驗結果4.1.1隱蔽平臺實驗結果經過一段時間的訓練學習,各組小鼠的逃避潛伏期均有不同程度的縮短,因此,Morris水迷宮隱蔽平臺實驗適用于本研究。正常對照組的下降趨勢最為明顯,說明其學習記憶能力較好,模型組的逃避潛伏期下降趨勢較為平緩,學習記憶能力較差,藥物組、脈沖電針組和音樂電針組逃避潛伏期的下降趨勢介于正常組和藥物組之間,說明藥物、脈沖電針和音樂電針三種不同的治療方法均能在一定程度上改善模型小鼠的空間學習能力,且脈沖電針組逃避潛伏期的下降趨勢較藥物組明顯,音樂電針組逃避潛伏期的下降趨勢較脈沖電針組明顯。在訓練的第1天,模型組的逃避潛伏期已與正常組出現(xiàn)了統(tǒng)計學差異(P0.05),在訓練的第2至5天,兩組之間逃避潛伏期的差異進一步加大(P0.01),說明7月齡APP/PS1雙轉基因小鼠存在明顯的空間學習能力障礙。在訓練的第3至5天,藥物組、脈沖電針組和音樂電針組的逃避潛伏期均短于模型組(P0.01),說明經過15天的治療,藥物、脈沖電針和音樂電針均能夠提高小鼠的空間學習能力。在訓練的第4至5天,脈沖電針組和音樂電針組的逃避潛伏期明顯短于藥物組(P0.05),音樂電針組的逃避潛伏期短于脈沖電針組,但兩者之間沒有統(tǒng)計學差異(P0.05)。4.1.2空間探索實驗結果模型組目標象限游泳時間在總時間中的占比明顯低于正常對照組(P0.01),表明APP/PS1雙轉基因小鼠存在明顯的空間記憶能力障礙。藥物組、脈沖電針組和音樂電針組目標象限游泳時間在總時間中的占比明顯高于模型組(P0.05、P0.01、P0.01),說明經過15天的治療,藥物、脈沖電針和音樂電針均可以改善AD模型小鼠的空間記憶能力,其中音樂電針組優(yōu)于藥物組(P0.01),藥物組與脈沖電針組、脈沖電針組與音樂電針組之間無統(tǒng)計學差異(P0.05),音樂電針組目標象限游泳時間在總時間中的占比高于脈沖電針組,但兩者之間沒有統(tǒng)計學差異(P0.05)。模型組穿越平臺次數(shù)明顯少于正常對照組(P0.01),說明APP/PS1雙轉基因小鼠存在明顯的空間記憶能力障礙。藥物組、脈沖電針組、音樂電針組穿越平臺次數(shù)多于模型組(P0.05、P0.05、P0.01),說明經過15天的治療,藥物、脈沖電針和音樂電針均可以改善AD模型小鼠的空間記憶能力,其中藥物組、脈沖電針組、與音樂電針組之間無統(tǒng)計學差異(P0.05),音樂電針組穿越平臺次數(shù)多于脈沖電針組,但兩者之間沒有統(tǒng)計學差異(P0.05)。4.2免疫組化DAB染色結果COX-2主要在小鼠海馬中的小膠質細胞的細胞膜和細胞質中表達。陽性細胞呈棕色,主要主要染色在細胞膜上,胞漿中也有輕微少量的著色,TGF-β1主要在小鼠的海馬中表達,表達部位為小膠質細胞的細胞膜,細胞質和軸突,陽性細胞為黃色顆粒。與其他組相比,正常對照組陽性細胞數(shù)較少,細胞染色淺,模型組陽性細胞數(shù)明顯高于正常對照組,且著色較深,藥物組和脈沖電針組與模型組比較,陽性細胞數(shù)量相對較多,顏色也較深。與模型組相比,藥物組和脈沖電針組的數(shù)量相對較少,且顏色也較淡。各組小鼠海馬區(qū)COX-2、TGF-β1的陽性細胞數(shù)統(tǒng)計學分析結果:模型組的陽性細胞數(shù)明顯多于正常對照組(P0.01),說明7月齡的APP/PS1雙轉基因小鼠腦內出現(xiàn)了明顯的炎性反應,炎性因子COX-2、TGF-β1的表達增加。藥物組、脈沖電針組和音樂電針組的陽性細胞數(shù)均明顯少于模型組(P0.01),說明經過15天的治療,藥物、脈沖電針和音樂電針均可降低AD模型小鼠腦內炎性物質COX-2、TGF-β1的表達。藥物組、脈沖電針組和音樂電針組之間無統(tǒng)計學差異(P0.05),音樂電針組的陽性細胞數(shù)少于脈沖電針組,但兩者之間無統(tǒng)計學差異(P0.05)。4.3 Western blot 檢測結果模型組COX-2的相對表達量明顯多于正常對照組(P0.01),說明7月齡的APP/PS1雙轉基因小鼠腦內出現(xiàn)了明顯的炎性反應,炎性因子COX-2的相對表達量增加。藥物組、脈沖電針組和音樂電針組的COX-2的相對表達量均明顯少于模型組(P0.05、P0.01、P0.01),說明經過15天的治療,藥物、脈沖電針和音樂電針均可降低AD模型小鼠腦內炎性物質COX-2的表達。藥物組、脈沖電針組和音樂電針組之間無統(tǒng)計學差異(P0.05),音樂電針組的COX-2的相對表達量少于脈沖電針組,但兩者之間無統(tǒng)計學差異(P0.05)。模型組TGF-β1的相對表達量明顯多于正常對照組(P0.01),說明7月齡的APP/PS1雙轉基因小鼠腦內出現(xiàn)了明顯的炎性反應,炎性因子TGF-β1的相對表達量增加。藥物組、脈沖電針組和音樂電針組的TGF-β1的相對表達量均明顯少于模型組(P0.05、P0.05、P0.01),說明經過15天的治療,藥物、脈沖電針和音樂電針均可降低AD模型小鼠腦內炎性物質TGF-β1的表達。藥物組、脈沖電針組和音樂電針組之間無統(tǒng)計學差異(P0.05),音樂電針組的TGF-β1的相對表達量少于脈沖電針組,但兩者之間無統(tǒng)計學差異(P0.05)。5.研究結論(1)本實驗選擇的APPswe/PS1dE9雙轉基因小鼠在7月齡時已經了學習記憶功能的障礙和小膠質細胞的活化及炎性因子的釋放,是研究AD較為理想的動物模型。(2)在“通督啟神”法理論指導下,脈沖電針和音樂電針均可提高模型小鼠的空間學習能力和空間記憶能力,但兩者之間無統(tǒng)計學差異,僅從數(shù)值上看出音樂電針組優(yōu)于脈沖電針組。(3)“通督啟神”法脈沖電針和音樂電針均可減輕AD模型小鼠海馬組織炎性細胞因子COX-2、TGF-β1的表達,但兩者之間無統(tǒng)計學差異,僅從數(shù)值上看出音樂電針組優(yōu)于脈沖電針組。
【圖文】：

避潛伏期的下降趨勢較藥物組明顯，音樂電針組逃避潛伏期的下降趨勢較脈沖電針組明逡逑顯。逡逑如表１、圖２所示，，在訓練的第１天，模型組的逃避潛伏期己與正常組出現(xiàn)了統(tǒng)計逡逑學差異（Ｐ＜0．0５），在訓練的第２至５天，兩組之間逃避潛伏期的差異進一步加大（Ｐ＜０．０１），逡逑說明７月齡ＡＰＰ／ＰＳ１雙轉基因小鼠存在明顯的空間學習能力障礙。在訓練的第３至５逡逑天，藥物組、脈沖電針組和音樂電針組的逃避潛伏期均短于模型組（Ｐ＜０．０１），說明經逡逑過１５天的治療，藥物、脈沖電針和音樂電針均能夠改善模型小鼠的空間學習能力。在逡逑訓練的第４至５天，脈沖電針組和音樂電針組的逃避潛伏期明顯短于藥物組（Ｐ＜０．０５），逡逑音樂電針組的逃避潛伏期短于脈沖電針組，但是兩者沒有統(tǒng)計學差異（Ｐ＞０．０５）。逡逑４５逡逑

２．１邐Ｍｏｒｒｉｓ水迷宮實驗結果逡逑２．１．１邐Ｍｏｒｒｉｓ水迷宮隱蔽平臺實驗結果逡逑如表１、圖３所示，經過一段時間的訓練學習，各組小鼠的逃避潛伏期均有不同程逡逑度的縮短。正常對照組的下降趨勢最為明顯，說明其學習記憶能力較好，模型組的逃避逡逑潛伏期下降趨勢較為平緩，說明學習記憶能力較差，藥物組、脈沖電針組和音樂電針組逡逑逃避潛伏期的下降趨勢介于正常組和藥物組之間，說明藥物、脈沖電針和音樂電針三種逡逑不同的治療方法均能在一定程度上改善模型小鼠的空間學習能力，其中，脈沖電針組逃逡逑避潛伏期的下降趨勢較藥物組明顯，音樂電針組逃避潛伏期的下降趨勢較脈沖電針組明逡逑顯。逡逑如表１、圖２所示，在訓練的第１天，模型組的逃避潛伏期己與正常組出現(xiàn)了統(tǒng)計逡逑學差異（Ｐ＜0．0５），在訓練的第２至５天，兩組之間逃避潛伏期的差異進一步加大（Ｐ＜０．０１），逡逑說明７月齡ＡＰＰ／ＰＳ１雙轉基因小鼠存在明顯的空間學習能力障礙。在訓練的第３至５逡逑天
【學位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R245;R-332

【參考文獻】

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本文編號：2655777