【摘要】：目的肺炎鏈球菌的莢膜多糖(Capsule,CPS)是肺炎鏈球菌重要的毒力因子,而磷壁酸(teichoic acid,TAs)是革蘭陽性菌細胞壁上特有的成分并且維持細胞形態(tài),兩者都在細菌的粘附、侵襲的過程中發(fā)揮了重要作用,但它們錨定到細胞壁的合成過程尚不清楚。LytR蛋白(SPD_1741)屬于LytR-Cps-Psr(LCP)家族成員,LCP蛋白家族在多種細菌中被證明參與細胞壁多糖錨定在肽聚糖上的過程,但尚不清楚LytR(SPD_1741)蛋白是否參與肺炎鏈球菌細胞壁多糖的表面錨定過程。本研究初步探索了LytR蛋白(SPD_1741)在細菌莢膜多糖和磷壁酸表面錨定中的作用,并進一步觀察了其對細菌表型和毒力的影響,為了解肺炎鏈球菌莢膜和磷壁酸生物合成的分子機制提供新的實驗證據(jù),并為抗肺炎鏈球菌感染的治療提供新的作用靶點。方法采用Western blot技術(shù)分析LytR蛋白的表達時相;通過流式細胞術(shù)(FACS)測定野生菌表面的LytR蛋白含量并確定LytR蛋白的位置;采用長臂同源重組技術(shù)構(gòu)建ΔlytR缺陷菌,采用質(zhì)粒pJWV25構(gòu)建lytR異位回補菌;體外培養(yǎng)野生菌、ΔlytR缺陷菌、lytR異位回補菌和外源性添加Lyt R蛋白的缺陷菌,繪制生長曲線以觀察細菌的繁殖能力,并利用透射電鏡觀察細菌的細胞壁及莢膜的變化;利用Western blot,ELISA和Dot blot等技術(shù)檢測野生菌、ΔlytR缺陷菌、lytR異位回補菌和外源性添加Lyt R蛋白的缺陷菌磷壁酸和莢膜多糖變化;通過細胞粘附實驗,抗巨噬細胞吞噬能力實驗,鼻腔攻毒實驗分析細菌的毒力差異;采用EMSA實驗分析LytR蛋白與lytA、cps、raf X操縱子啟動子結(jié)合情況。結(jié)果LytR蛋白在野生菌的不同生長時期的表達量較高且無顯著差異。FACS結(jié)果顯示LytR蛋白可表達于細菌的表面;相比D39野生菌,D39ΔlytR缺陷菌表現(xiàn)出生長遲緩、平臺期變短、自溶提前、細胞壁不完整、磷壁酸含量減少、莢膜殘缺的現(xiàn)象。D39lyt R異位回補菌及外源性添加蛋白的D39ΔlytR缺陷菌,其生長均得到恢復,莢膜和細胞壁與D39野生菌則無顯著差異。相比D39野生菌、D39lyt R異位回補菌、外源性添加蛋白的D39ΔlytR缺陷菌,D39ΔlytR缺陷菌全菌的莢膜多糖和磷壁酸的含量明顯減少(p0.05),而在其培養(yǎng)上清中的含量卻明顯增加(p0.05)。體外粘附實驗顯示R6Δlyt R缺陷菌相比野生菌的粘附能力顯著下降(p0.05)。體外抗吞噬實驗顯示巨噬細胞對D39ΔlytR缺陷菌較野生菌粘附的能力顯著減弱(p0.05)。小鼠感染D39野生菌死亡率達到83.3%,而感染D39ΔlytR缺陷菌死亡率為0%,二者有顯著差異(p0.05)。感染D39野生菌的小鼠肺組織出現(xiàn)了大量的炎癥細胞浸潤、充血、肺間質(zhì)增生等變化,而感染D39ΔlytR缺陷菌小鼠的肺部炎癥反應(yīng)較輕。EMSA結(jié)果顯示LytR蛋白并未與lytA、cps、rafX操縱子啟動子特異結(jié)合。結(jié)論LytR蛋白在肺炎鏈球菌中穩(wěn)定表達,可能參與莢膜多糖、磷壁酸在細胞壁表面的錨定過程,并影響到細菌的形態(tài)、生長、自溶和毒力。
【圖文】：

重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文為了研究 LytR 蛋白的功能，，我們采用長臂同源重組的方式，利用 erm 基因取代 lytR 基因的方式構(gòu)建Δ lytR 缺陷菌。首先，利用特異引物（LytR P1、P23、P4）分別擴增 lytR 基因上游側(cè)臂 820 bp（lytR UP）及其下游側(cè)臂 820 bp（lW）片段（圖 1A）；隨后，利用 PCR 技術(shù) lytR UP 上游 ,erm 抗性基因盒和 lytR D游相連接（圖 1A），將連接片段轉(zhuǎn)化至 S.pn D39 菌株中。采用具有紅霉素抗血平板進行初步篩選。隨機挑選兩個單克隆菌落（C1 和 C2），用 PCR 和 Westlot 鑒定。圖 B 表明，lytR 片段存在于野生菌中，并不存在于Δ lytR 缺陷菌中。rm 片段存在于Δ lytR 缺陷菌中，卻并不存在于野生菌。該結(jié)果證明已成功構(gòu)建 lytR 缺陷菌。 實驗結(jié)果.1 構(gòu)建并驗證ΔlytR 缺陷菌

3.2 構(gòu)建并驗證ΔlytR mutant-complement 回補菌利用限制性內(nèi)切酶Spe I 和Not I將基因lytR全長片段與pJWV25質(zhì)粒相連接，隨后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至 S.pn D39 菌株中進行篩選。隨機挑選菌落進行 PCR 驗證后，再送北京擎科科技有限公司進行 DNA 序列測定和進行 Western bolt 驗證。圖 2A顯示測定的 DNA 序列與 lytR 序列百分之百吻合，圖 2B 顯示，WT 肺炎鏈球菌在35kDa 分子量與 40kDa 分子量之間的位置有一清晰雜交條帶，與 lytR 的分子量相吻合，即該條帶為 LytR 蛋白；而Δ lytR mutant-complement 回補菌在 55kDa 分子量與 70kDa 分子量之間的位置有一條清楚的雜交條帶，而 LytR 分子量為 37.57 kDa加上標簽蛋白 GFP（分子量 26.9 kDa），剛好為 64.47kDa 分子量，提示該條帶為LytR 與 GFP 的融合蛋白條帶，這一結(jié)果證明Δ lytR mutant-complement 回補菌可以成功的表達 LytR 蛋白。以上的結(jié)果顯示，成功構(gòu)建了Δ lytR mutant-complement 回補菌(簡寫為Δ lytR-C)。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R378.14

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