【摘要】：Ⅰ型單純皰疹病毒(herpes simplex virus type 1,HSV-1)是人群中常見的病毒,可引起人類多種疾病,已成為嚴重危害人類健康的重要病原之一,目前尚無有效的藥物和疫苗。HSV-1 UL2基因編碼的UL2蛋白是一種尿嘧啶-DNA糖基化酶(Uracil-DNA glycosylase,UDG),它能精確地從合成的DNA中切除錯誤摻入的尿嘧啶,這在病毒復制過程中的堿基修復中起著重要的作用。此外,雖然UL2對病毒在體外細胞培養(yǎng)中的復制不是必需的,但是對病毒在神經(jīng)元中的有效復制是必需的。因此,UL2在病毒的致病性、潛伏和再激活中可能發(fā)揮著重要作用。目前,關于HSV-1 UL2在病毒感染中的確切功能還不是很清楚。本研究中,為了分析UL2在活細胞中的分布情況,我們利用分子克隆技術首先將UL2的全長開放讀碼框與增強型黃色熒光蛋白(Enhanced yellow fluorescence protein,EYFP)融合構建相應真核表達質粒,將其轉染COS-7細胞后發(fā)現(xiàn),在其它病毒蛋白不存在的情況下,UL2在活細胞內主要定位在細胞核內,證實它是一個核靶向蛋白。通過構建一系列與EYFP融合的UL2缺失或定點突變體表達質粒并將其轉染COS-7細胞后進行熒光定位分析,結果發(fā)現(xiàn)UL2含有一個功能性的核輸入信號(Nuclear localization signal,NLS)(~1MKRACSRSPSPRRRPSS~(17)),它的關鍵氨基酸(Amino acids,aa)是~(12)RRR~(14)。同時,我們也證實預測的核輸出信號(Nuclear export signal,NES)不起作用。利用Ran-GTP、importinα/β顯性負突變體和抑制劑及免疫共沉淀實驗等進一步研究顯示,UL2是在RanGTP提供能量情況下通過importinα1、α5、α7、β1和transportin-1多種受體介導的方式進入細胞核。此外,異源核融合實驗證實了UL2是一種核質穿梭蛋白。根據(jù)鑒定到的UL2 NLS及其關鍵aa,我們利用Red同源重組技術在含HSV-1BAC Luc的大腸桿菌GS1783中構建了UL2 NLS突變型(UL2 NLSm)、UL2缺失型(?UL2)和UL2回復型(?UL2R)相關重組病毒的細菌人工染色體(Bacterial artificial chromosome,BAC),并將它們轉染Vero細胞后獲得相應重組病毒。通過病毒滴度測定實驗確定了獲得的重組病毒滴度,同時重組病毒的生長曲線實驗結果表明UL2的核輸入對病毒的有效復制是至關重要的,UL2缺失的病毒的復制減弱。因此,以上這些研究結果將為深入闡明UL2在HSV-1感染中的生物學功能奠定基礎,也為進一步的抗病毒藥物靶點設計和疫苗研制提供理論依據(jù)。
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AHSV-1的結構模式圖

衣殼和包膜之間蛋白區(qū)域組成的無規(guī)則結構，稱為皮層。HSV-1 的基因組是一個大小約 150Kbp 的線性雙鏈 DNA 分子，其結構由兩個共價連接的片段 L（長）和S（短片段）組成，兩側是反向重復序列IRL和TRL以及IRS和TRS（圖1-1B）。而衣殼呈二十面體立體對稱，由4種蛋白組成，它們分別是主要衣殼蛋白（VP5）、支架蛋白（pre-VP22a）、VP19C 和 VP23。HSV-1 的包膜含有大約 11 種病毒糖蛋白，，其中 4 種糖蛋白（gD、gH、gL 和 gB）是 HSV-1 進入細胞所必需的。gC 和
【學位授予單位】：廣州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R373.11

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 盧建紅;唐運蓮;李桂源;;以BAC為基礎的皰疹病毒感染性克隆技術[J];中國生物工程雜志;2006年06期

本文編號：2647142