發(fā)布時間：2020-04-21 21:34

【摘要】：目的掌握自體脂肪間充質(zhì)干細胞(ADSCs)的提取以及培養(yǎng)方法,觀察干擾素γ(IFN-γ)增強成人自體ADSCs對外周血淋巴細胞免疫調(diào)節(jié)作用及機制。方法本研究方法為收集健康人體的ADSCs,將ADSCs進行培養(yǎng)至第3代,觀察細胞形態(tài),對細胞表面分化抗原進行流式細胞鑒定,同時對細胞進行成脂以及成骨細胞分化實驗,對ADSCs進行鑒定。收集分離外周血單個核細胞(PBMCs),與ADSCs建立共培養(yǎng)體系共培養(yǎng)5d,在共培養(yǎng)體系中加入植物血凝素(PHA)和白細胞介素(IL-)2來活化T細胞。本研究共分三組,一組為IFN-γ誘導(dǎo)ADSCs的IFN-γ刺激組,一組為沒有IFN-γ誘導(dǎo)的未刺激組,一組為IFN-γ誘導(dǎo)ADSCs后又加入1-甲基色氨酸(1-MT)的IDO阻斷組。對照組單純采用PHA和IL-2刺激T細胞。每組與PBMCs按一定的比例共培養(yǎng),采用MTT法檢測T細胞增殖吸光度值,進而計算出T細胞增殖抑制率。使用流式細胞術(shù)檢測出活化T細胞CD4+CD25+Treg比例。檢測IFN-γ對IDO基因以及蛋白水平的變化。結(jié)果ADSCs傳3代后形態(tài)為典型的紡錘形,貼壁生長;分離的自體ADSCs高表達分化群(CD)73、CD90、CD105陽性率均95%,低表達造血干細胞表面標志CD34、CD45,流式細胞術(shù)鑒定表面標志物符合國際標準;ADSCs具有分化為成脂和成骨細胞的能力。ADSCs與淋巴細胞比例為1:50時,增殖抑制率為(20.25±3.10)%,比例為1:10時增殖抑制率為(52.75±4.85)%,比例為1:5時增殖抑制率為(65.75±5.12)%,T細胞的增值抑制率和細胞比例呈劑量依賴關(guān)系,IFN-γ預(yù)刺激組ADSCs與淋巴細胞比例為1:50時,增殖抑制率為(48.00±5.35)%,比例為1:10時增殖抑制率為(70.75±4.19)%,比例為1:5時增殖抑制率為(79.50±6.19)%,T細胞的增值抑制率和細胞比例呈劑量依賴關(guān)系,并高于未刺激組;IFN-γ預(yù)刺激組CD4~+CD25~+Treg比例為(22.05±2.43)%與未刺激組相比顯著升高;IFN-γ預(yù)刺激組ADSCs內(nèi)IDO mRNA表達水平顯著高于未刺激組;IFN-γ預(yù)刺激組ADSCs內(nèi)IDO蛋白表達水平顯著高于未刺激組;IDO阻斷組對活化T細胞增殖抑制率較IFN-γ預(yù)刺激組顯著降低(P0.01)。結(jié)論隨ADSCs與T細胞共培養(yǎng)比例增大,ADSCs對活化T細胞增殖的抑制率顯著提高,呈劑量依賴關(guān)系。進一步利用IFN-γ預(yù)處理ADSCs,結(jié)果發(fā)現(xiàn)IFN-γ刺激顯著增強ADSCs負性調(diào)節(jié)作用。利用IFN-γ預(yù)處理ADSCs后ADSCs誘導(dǎo)活化T細胞向CD4~+CD25~+Treg亞群轉(zhuǎn)化的能力增強。PCR實驗發(fā)現(xiàn)IDO mRNA表達受IFN-γ影響,IFN-γ能促進IDO mRNA表達。在蛋白質(zhì)水平上,IFN-γ也能促進IDO蛋白表達。使用1-MT后能很大程度上抑制ADSCs介導(dǎo)的免疫抑制。總而言之,IFN-γ促進ADSCs對活化T細胞免疫抑制能力,IDO在ADSCs介導(dǎo)的免疫抑制中起重要免疫調(diào)節(jié)作用。
【圖文】：

圖 1.1 外周血單個核細胞分層1.1.3.9 ADSCs 對自體 T 細胞增殖能力的影響噻唑藍（MTT）比色法是一種檢測細胞生長和存活狀態(tài)的方法，具有快速、簡便、靈敏等優(yōu)點。活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶可以使噻唑藍還原為不溶于水的藍紫色結(jié)晶并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。對于細胞增殖的檢測，當細胞增殖率較高時，由于活細胞數(shù)量較多，會導(dǎo)致溶液顏色較深。二甲基亞砜能溶解沉積在細胞中的藍紫色結(jié)晶，通過酶標儀檢測波長在 490 nm 處的光密度值，可間接反映活細胞數(shù)量。（1）使用傳代三代的 ADSCs 進行實驗，當 ADSCs 融合至 90%時細胞狀態(tài)最好，加入 0.5mL 的胰酶對細胞進行消化，使細胞都盡量成為單個細胞，不要粘連，消化結(jié)束后加入 5mL 完全培養(yǎng)基將細胞充分吹勻。（2）收集細胞至離心管中，300g 離心 5min，收集細胞沉淀，加入 1mL 完

SCs 的細胞形態(tài)ADSCs接種于培養(yǎng)瓶24 h后均可見貼壁細胞，呈圓形或多角形，48h后首次換液，細胞貼壁較牢固，4～5d后梭形細胞逐漸樣生長，，形成逐漸呈長梭形外觀，10 d左右時，細胞集落達到生長，細胞間緊密排列有一定方向感。約16 d左右細胞長滿瓶狀鏡下可見主要呈長梭形，增長趨勢穩(wěn)定，并成幾何倍數(shù)關(guān)DSCs形態(tài)比較均為典型的紡錘形，（見圖1.2）；ADSCs爬片色后,可見細胞主要呈梭形，也有多角形等形態(tài)，胞核染成紫紫色（見圖1.3）。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R392

【參考文獻】

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1 姜雪明;章志翔;高超;劉彤;田偉軍;戚峰;韓洪秋;王浩;;吲哚胺2,3-雙加氧酶在間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)腎移植免疫耐受中的作用[J];實用器官移植電子雜志;2013年03期

2 秦秀軍;張偉;李建國;魏錦萍;闞衛(wèi)軍;李榮榮;;人脂肪間充質(zhì)干細胞的致瘤性研究[J];天津醫(yī)藥;2013年02期

3 戎麗娟;池穎;楊少光;陳丹丹;陳芳;徐淑霞;張冬雷;馬鳳霞;盧士紅;韓忠朝;;干擾素γ對人臍帶間充質(zhì)干細胞生物學特性及免疫調(diào)節(jié)功能的影響[J];中國實驗血液學雜志;2012年02期

本文編號：2635765