【摘要】：目的:通過原核重組表達獲得鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii,AB)重組蛋白OmpK、Omp22及Omp K/Omp22融合蛋白,動物免疫接種后檢測并比較分析其免疫原性和免疫保護性,探討構建鮑曼不動桿菌基因重組亞單位疫苗的新策略。方法:1.采用PCR的方法以鮑曼不動桿菌標準菌株ATCC19606基因組DNA為模板擴增OmpK、Omp22基因,并通過重疊延伸PCR獲得OmpK/Omp22融合基因,將OmpK、Omp22基因及OmpK/Omp22融合基因分別克隆入pColdI質粒載體,對篩選到的重組質粒進行酶切鑒定和DNA測序鑒定。將重組質粒分別轉化大腸桿菌BL21(DE3)株,重組菌經異丙基硫代半乳糖苷誘導后,鎳親和柱純化重組蛋白。2.分別將3種重組蛋白各20μg(溶于PBS緩沖液50μL)與等體積弗氏佐劑混合后作為抗原免疫接種Balb/c小鼠,并于初次免疫后第14、21天以相同劑量重組蛋白與弗氏佐劑混合后各加強免疫一次,設置PBS對照組(即只給每只動物注射PBS溶液50μL和等體積弗氏佐劑)。于末次免疫后第7、21天小鼠內眥取血,酶聯(lián)免疫吸附試驗測定抗血清效價。3.末次免疫后第3周分離小鼠脾淋巴細胞,體外經相應抗原刺激后,MTT法檢測脾淋巴細胞增殖水平,ELISA法測定IFN-γ細胞因子釋放水平。4.末次免疫3周后以鮑曼不動桿菌臨床分離株攻擊免疫小鼠,記錄小鼠存活率,采集小鼠外周血檢測其細菌載量,分離小鼠肺組織HE染色后觀察其病理變化。結果:成功構建了3個重組質粒pColdI-OmpK/Omp22、pColdI-OmpK、pColdI-Omp22,轉化大腸桿菌BL21(DE3)株后經IPTG誘導可表達分子量與理論值一致的3個重組蛋白OmpK/Omp22、OmpK、Omp22,純化的重組蛋白免疫小鼠后獲得的抗血清均具有特異性,末次免疫后的第7、21天融合蛋白OmpK/Omp22免疫組小鼠血清抗體滴度明顯高于Omp K免疫組及Omp22免疫組(P0.05)。Omp K/Omp22免疫組小鼠的脾淋巴細胞經相應抗原再次刺激后的淋巴細胞增殖率明顯高于OmpK免疫組及Omp22免疫組(P0.05)。OmpK/Omp22、OmpK、Omp22免疫小鼠脾淋巴細胞IFN-γ產量分別為:0.521±0.069ng/mL,0.48±0.042ng/mL,0.485±0.050ng/mL均高于PBS對照組(0.423±0.1088ng/mL)。PBS對照組小鼠受到鮑曼不動桿菌臨床分離菌株攻擊感染后72h內全部死亡,而直至攻擊感染后第8天OmpK/Omp22、Omp K、Omp22免疫組小鼠存活率分別為66.7%,25%,37.5%。OmpK/Omp22、OmpK、Omp22免疫小鼠外周血細菌載量均低于PBS對照組(P0.05),而OmpK/Omp22融合蛋白組細菌載量最低(P0.01)。肺組織HE染色結果顯示PBS對照組肺組織存在嚴重的間質性肺炎改變,其血管周圍可見大量炎性細胞浸潤,OmpK和Omp22免疫小鼠的肺組織出現(xiàn)中等度肺炎改變及中等度的炎性細胞浸潤,而Omp K/Omp22融合蛋白免疫組小鼠肺組織僅表現(xiàn)為輕度的炎癥反應和極少量炎性細胞浸潤。結論:3種重組蛋白小鼠免疫接種后均表現(xiàn)出較強的免疫原性和一定程度的免疫保護性,融合蛋白OmpK/Omp22的免疫原性和免疫保護性明顯強于單個重組蛋白OmpK及Omp22。該研究結果可為進一步優(yōu)化鮑曼不動桿菌亞單位疫苗分子設計以及構建包含多個抗原組分的多亞單位疫苗等研究提供參考依據(jù)。
【圖文】：

曼不動桿菌 OmpK、Omp22 基因及 OmpK/Omp22 融合PCR 擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖（DL2000）；1：OmpK 基因 PCR 擴增產物；2：Omp22 融合基因的 PCR 擴增產物菌 OmpK、Omp22 及 OmpK/Omp22 基因mp22 基因及 OmpK/Omp22 融合基因經 B與經 BamHⅠ/SalⅠ雙酶切的載體進行連接隨機挑取陽性克隆提取質粒，篩選到分子量組質粒，，分別命名為 pColdI-OmpK/Omp22、，3 種重組質粒經限制性內切酶消化后進行Omp22 經 BamH I 和 SalⅠ雙酶切后釋放 pK 經 BamH I 和 SalⅠ雙酶切后釋放 750b

圖 2 重組表達質粒 pColdI-OmpK 的酶切鑒定圖譜分子量標準(λDNA EcoRⅠ/HindⅢ); 1：質粒 pColdI; 2:重組質粒 pColdI-OmpK; 3 經 BamHⅠ單酶切分析; 4: 重組質粒 pColdI-OmpK 經 BamHⅠ單酶切分析；5：重-OmpK 的 BamHⅠ/SalⅠ雙酶切分析
【學位授予單位】：川北醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R392

【參考文獻】

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1 Ming-Feng Lin;Chung-Yu Lan;;Antimicrobial resistance in Acinetobacter baumannii : From bench to bedside[J];World Journal of Clinical Cases;2014年12期

2 謝勇恩;唐恩潔;任碧軒;;DNA免疫法制備抗Prohibitin多克隆抗體的實驗研究[J];免疫學雜志;2010年07期

本文編號：2622593