【摘要】：眾所周知,活性氧(reactive oxygen species,ROS)是一種氧代謝副產(chǎn)物,普遍存在于所有細胞中,與抗氧化劑相互平衡。當細胞中活性氧含量過量或抗氧化劑耗竭又或者兩者兼而有之時,會導致這種微妙的平衡受到干擾,發(fā)生氧化應激。在活性氧處于中等水平時,活性氧可以發(fā)揮一些積極作用,參與相關(guān)的信號傳導途徑,例如針對病原體的防御或精子中的受精準備。然而,過高水平的活性氧以其破壞作用被大眾所知,影響所有生物分子并最終導致細胞應激甚至死亡。線粒體是哺乳動物細胞中ROS的主要產(chǎn)生者和靶標。人類精子內(nèi)活性氧水平氧化應激導致精液參數(shù)異常,與男性不育癥密切相關(guān),已成為男性不育的重要因素。自噬對應激反應做出應答及清除氧化受損細胞器起重要作用。本研究以人類精子為實驗材料,建立精子氧化應激方法,利用免疫熒光結(jié)合激光共聚焦熒光顯微鏡觀察外源性過氧化氫和超低溫保存這兩種形式的氧化應激對人類精子內(nèi)自噬的影響。首先采用非連續(xù)密度梯度法優(yōu)選人類精子,降低精液中雜質(zhì)對實驗結(jié)果的影響;利用計算機輔助精子分析精液常規(guī)參數(shù);不同濃度的外源性過氧化氫處理精子(0 mM H_2O_2、0.5 mM H_2O_2、1 mM H_2O_2),建立氧化應激方法;程序性液氮超低溫保存精子標本,建立氧化應激方法;利用DCFH-DA探針染色的方法檢測人類精子內(nèi)活性氧水平;利用MitoTracker?Red CMXRos探針染色的方法檢測人類精子線粒體膜電位變化情況;利用Western Blot驗證人類精子內(nèi)自噬起始蛋白的表達;利用免疫熒光結(jié)合激光共聚焦熒光顯微鏡觀察人類精子內(nèi)自噬相關(guān)蛋白的表達定位;利用免疫熒光共定位結(jié)合激光共聚焦熒光顯微鏡觀察人類精子線粒體自噬蛋白的表達定位。取得的主要結(jié)果如下:(1)新鮮精液液化后,采用非連續(xù)密度梯度離心法優(yōu)選后的人類精子。經(jīng)計算機輔助精子分析,洗滌后與洗滌前相比,PR%顯著升高,PR+NP%也顯著升高。(2)經(jīng)計算機輔助精子分析,過氧化氫組(0.5 mM H_2O_2、1 mM H_2O_2)與對照組(H_2O)相比PR%顯著降低,PR+NP%也顯著降低。分析精子內(nèi)活性氧水平發(fā)現(xiàn),過氧化氫組(0.5 mM H_2O_2、1 mM H_2O_2)與對照組(H_2O)相比精子內(nèi)活性氧水平顯著升高。對精子線粒體膜電位分析發(fā)現(xiàn),過氧化氫組(0.5 mM H_2O_2、1 mM H_2O_2)與對照組(H_2O)相比精子線粒體膜電位顯著降低。Western Blot驗證人類精子內(nèi)自噬起始蛋白,結(jié)果顯示,過氧化氫組(0.5 mM H_2O_2)與對照組(H_2O)相比精子內(nèi)LC3-II/LC3-I比值顯著升高。免疫熒光結(jié)合激光共聚焦熒光顯微鏡分析,自噬蛋白LC3表達主要位于精子頭部及尾部中段,過氧化氫組(0.5 mM H_2O_2、1 mM H_2O_2)與對照組(H_2O)相比LC3表達量顯著升高;自噬蛋白p62表達主要位于精子頭部及尾部中段,過氧化氫組(0.5 mM H_2O_2、1 mM H_2O_2)與對照組(H_2O)相比p62表達量顯著升高。免疫熒光結(jié)合激光共聚焦熒光顯微鏡分析發(fā)現(xiàn),外源性過氧化氫處理后,自噬蛋白LC3與精子線粒體共定位,表明線粒體發(fā)生自噬。(3)經(jīng)計算機輔助精子分析,融解后與冷凍前相比PR%顯著降低、PR+NP%也顯著降低。分析精子內(nèi)活性氧水平發(fā)現(xiàn),融解后與冷凍前相比精子內(nèi)活性氧水平極顯著升高。對精子線粒體膜電位分析發(fā)現(xiàn),融解后與冷凍前相比精子線粒體膜電位顯著降低。免疫熒光結(jié)合激光共聚焦熒光顯微鏡分析發(fā)現(xiàn),自噬蛋白LC3表達主要位于精子頭部及尾部,融解后與冷凍前相比LC3表達量極顯著升高;自噬蛋白p62表達主要位于精子頭部及尾部中段,融解后與冷凍前相比p62表達量極顯著升高。綜上所述,氧化應激(外源性過氧化氫和超低溫保存)對人類精子造成氧化損傷,使人類精子內(nèi)活性氧水平升高,線粒體膜電位下降,導致精子運動能力下降;過量活性氧導致的氧化應激激活精子自噬,但自噬過程受阻,自噬溶酶體降解效率低。
【圖文】：

p62 參與通過選擇性自噬降解泛素化和錯誤折疊的蛋白質(zhì)[45]。1-1 Involvement of p62 in the degradation of ubiquitinated and misfolded ective autophagy. 細胞內(nèi) p62 水平受轉(zhuǎn)錄調(diào)控和翻譯后自噬降解之間的平衡調(diào)節(jié)[45]。 1-2 Balanced regulation of intracellular p62 levels by transcriptional regulat

2)處理非連續(xù)密度梯度離心法優(yōu)選的人類精子，在37°C孵育1 h后。結(jié)果如圖4-1(A)所示，精子內(nèi)活性氧主要為尾部中段線粒體區(qū)域，隨著過氧化氫的濃度增加，活性氧在精子頭部彌散分布。結(jié)合軟件分析，對照組正常人類精子內(nèi)活性氧水平較低，H2O2組與對照組相比，，存在顯著差異(P < 0.05)，活性氧水平明顯高于對照組(H2O)。結(jié)合精液常規(guī)檢測的結(jié)果，可以得知人類精子在外源性過氧化氫的BWW 培養(yǎng)液中在 37°C 孵育 1 h 后，造?
【學位授予單位】：煙臺大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R321.1

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本文編號：2618590