【摘要】：目的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(PKB/Akt)信號通路在細胞進程中發(fā)揮至關(guān)重要的調(diào)控作用。Akt是該信號通路調(diào)控的關(guān)鍵成員。3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1(PDK1)位于Akt的上游,可以在Thr308位點將其磷酸化以激活其激酶活性。然而,除磷酸化之外,PDK1的翻譯后修飾很少報道。在此我們探索了PDK1(3-磷酸肌醇依賴蛋白激酶1)Neddylation修飾機制及對Akt磷酸化激酶活性的影響。方法免疫共沉淀(Co-IP)和蛋白質(zhì)印跡(WB)分析PDK1的Neddylation修飾機制,類泛素化修飾實驗篩選出Smurf1促進PDK1 Neddylation修飾,定點突變和免疫共沉淀和免疫印跡確定PDK1和Smurf1之間的相互作用區(qū)域。PDK1/Akt信號通路可通過EGF(表皮生長因子)或FBS(胎牛血清)刺激而起作用。在正常的MEF細胞中,表皮生長因子刺激誘導(dǎo)Akt的磷酸化在第5min時上調(diào),持續(xù)1小時而沒有顯著下降。為此我們選擇Smurf1敲除MEF細胞及Smurf1野生型MEF細胞,EGF刺激后觀察兩者之間的變化。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)了PDK1是NEDD8的新底物。我們驗證了Smad泛素調(diào)節(jié)因子-1(Smurf1),一種HECT型E3,是PDK1的NEDD8-E3。Smurf1 WW結(jié)構(gòu)域與PDK1相互作用并對其激酶結(jié)構(gòu)域進行neddylate,這可以增加PKD1的催化能力。敲低Smurf1或用MLN4924阻斷neddylation途徑會減弱Akt的磷酸化并弱化其細胞外信號傳導(dǎo)功能。結(jié)論Smurf1促進PDK1 Neddylation修飾并增強其激活A(yù)kt磷酸化的激酶活性,我們的研究提供了一個新的PDK1調(diào)節(jié)機制,并揭示PI3K/Akt途徑和neddylation途徑之間的新串聯(lián)。
【圖文】：

圖 6 PDK 參與部分癌癥發(fā)生發(fā)展除了表達數(shù)據(jù)之外，，PDK1 參與腫瘤發(fā)生的研究證據(jù)主要來自細胞模型中PDK1 的實驗性增加。在乳腺癌細胞中，PDK1 過表達能夠有效地誘導(dǎo)細胞懸浮生長[21-23]。此外，PDK1 在細胞中的過度表達導(dǎo)致腫瘤過度生長，例如在免疫受損小鼠中異種移植的人乳腺癌細胞中[23]。同樣，腫瘤細胞的運動能力和侵襲能力可以通過人工增加 PDK1 的表達水平來維持[15, 22]。4、PDK1 在腫瘤微環(huán)境中的作用越來越多的數(shù)據(jù)支持這樣的假設(shè)：腫瘤微環(huán)境（TME），特別是其細胞成分，如巨噬細胞，淋巴細胞，成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞，直接調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長和侵襲性[24, 25]。雖然 PDK1 在 TME 中的作用尚未經(jīng)過特定的研究，但它確實在這些細胞類型中有很多特征

IB: HAIB: FlagIB: FlagP:ILsatey共轉(zhuǎn) 239T 細胞檢測 PDK1 的f1 與 PDK1 有相互作用化修飾，然泛素連接酶 E3 是 PDK1 發(fā)生相互作用，故我EK293T 細 胞 內(nèi) 分 別1,Myc-c-IAP2[21],Myc-MDM作用（圖 2）。-PDK1Vector+ + ++-+ +NF168R c-IAP1 -cIAP2 DM2M Smurf1
【學(xué)位授予單位】：錦州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R363

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本文編號：2609545