發(fā)布時(shí)間：2020-03-30 23:01

【摘要】：研究背景:ECDI誘導(dǎo)的早期凋亡細(xì)胞已經(jīng)被作為有效且低毒性的免疫抑制方法應(yīng)用于治療自身免疫疾病的臨床研究,且在小鼠體內(nèi),可誘導(dǎo)胰島移植供體特異性免疫耐受形成,并且明顯延長(zhǎng)同種異體心臟及皮片移植的存活時(shí)間。但與此同時(shí),ECDI誘導(dǎo)的供體早期凋亡細(xì)胞相關(guān)免疫抑制機(jī)制仍不完全清楚。而M2型巨噬細(xì)胞作為非特異性免疫系統(tǒng)成員,在抑制炎癥反應(yīng),免疫抑制反應(yīng)中扮演重要的作用。研究目的:探索了供體ECDI-SPs與受體巨噬細(xì)胞極化方向的關(guān)系,揭示供體ECDI-SPs延長(zhǎng)移植物存活時(shí)間的相關(guān)機(jī)制,為此方法進(jìn)一步的臨床治療應(yīng)用提供了相應(yīng)理論基礎(chǔ)。研究方法:利用受體小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(Mφ)與供體小鼠ECDI-SPs體外共培養(yǎng)體系,首先通過(guò)流式細(xì)胞術(shù),對(duì)受體巨噬細(xì)胞吞噬ECDI誘導(dǎo)的供體脾臟單個(gè)核細(xì)胞的吞噬情況進(jìn)行了檢測(cè),并進(jìn)一步通過(guò)共培養(yǎng)體系,利用流式細(xì)胞術(shù)、RT-PCR以及Western Blot等技術(shù)對(duì)吞噬后受體巨噬細(xì)胞的極化方向、IL-10、IL-6等相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)以及吞噬后極化方向改變的相應(yīng)分子機(jī)制進(jìn)行了檢測(cè)。建立受體小鼠誘導(dǎo)極化后巨噬細(xì)胞與脾臟單個(gè)核細(xì)胞共培養(yǎng)體系,觀察極化后巨噬細(xì)胞對(duì)Treg細(xì)胞比例的影響。建立C57/BL6-Balb/c小鼠同種異體皮片移植模型,檢測(cè)在體情況下受體小鼠接受供體ECDI-SPs注射后,Mφ的極化方向與體外培養(yǎng)是否一致,同時(shí)檢測(cè)Treg比例,同時(shí)利用Luminex技術(shù)對(duì)小鼠血清相關(guān)炎癥及抑炎分子進(jìn)行檢測(cè)。研究結(jié)果:受體小鼠Mφ可明確吞噬ECDI處理后供體小鼠脾臟細(xì)胞,且吞噬后向M2方向極化,與吞噬未經(jīng)處理的供體脾臟細(xì)胞極化方向截然相反。吞噬ECDI-SPs后受體Mφ的IL-10分子表達(dá)顯著上調(diào),同時(shí)IL-6等炎癥因子表達(dá)受到抑制。受體小鼠Mφ吞噬ECDI-SPs后,通過(guò)增強(qiáng)CREB的磷酸化,促進(jìn)其自身向M2表型極化。誘導(dǎo)極化為M2型的巨噬細(xì)胞可進(jìn)一步促進(jìn)Treg細(xì)胞比例的上升。在體皮片移植模型情況下,與對(duì)照組相比,ECDI-SPs的注射同樣可促進(jìn)受體小鼠體內(nèi)Mφ向M2型極化,且明顯提高了Treg細(xì)胞比例,且排斥終點(diǎn)血清IL-10明顯升高,同時(shí)IL-6、IL-12p70、IL-2、TNF-α、IFN-γ的水平明顯降低,最終延長(zhǎng)了移植皮片的存活時(shí)間。研究結(jié)論:Mφ在吞噬同種異體ECDI處理的早期凋亡細(xì)胞后,通過(guò)增強(qiáng)CREB磷酸化,促進(jìn)自身向M2方向極化,促進(jìn)IL-10的分泌,抑制IL-6的生成,進(jìn)一步提升Treg比例,調(diào)控移植排斥反應(yīng),延長(zhǎng)移植物存活時(shí)間。
【圖文】：

1 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離后分層情況示體淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)體系的建立預(yù)先貼壁 C57BL/6 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中07個(gè)），各個(gè)孔分別加入 5×107個(gè) 分離得/c 小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞以及 ECDI 誘導(dǎo)凋腔巨噬細(xì)胞對(duì)供體早期凋亡細(xì)胞的吞噬對(duì)脾臟單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行 CFSE 染色。具0 的比例稀釋凍存的 2mmol/L 的 CFSE 儲(chǔ)度。重懸分離得到的小鼠脾臟單個(gè)核淋巴光染色 10min。反應(yīng)結(jié)束后，向單個(gè)核細(xì)冷的 RPMI1640 培養(yǎng)液（含 10%胎牛血

圖 2 腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬檢測(cè)圖 A 為 C57 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬自體及供體 Balb/c 小鼠 SPs 及 ECDI-SPs 的情況，CFSE 與 F4/80 雙陽(yáng)性的細(xì)胞可表示吞噬了脾臟細(xì)胞的巨噬細(xì)胞。圖 B 為腹腔巨噬細(xì)胞吞噬比例統(tǒng)計(jì)圖，ECDI 處理后，巨噬細(xì)胞的吞噬比例明顯上升。*P<0.05。圖 C 為巨噬細(xì)胞系 RAW264.7 對(duì) SPs 及 ECDI-SPs 的吞噬情況。3.2 Fox-O1 Lysm Cre 條件性敲除小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能檢測(cè)Fox-O1 分子作為巨噬細(xì)胞分泌 IL-10 分子的上游調(diào)控因子，在調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞吞噬及相關(guān)細(xì)胞因子分泌功能方面有一定影響。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有條件，即 Fox-O1 LysmCre 條件性敲除小鼠，我們對(duì)基因敲除小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞進(jìn)行了提取，并利用了同樣的共培養(yǎng)體系及方法，對(duì)其吞噬功能進(jìn)行了檢測(cè)。與野生型小鼠相比，F(xiàn)ox-O1 LysmCre 條件性敲除小鼠對(duì) ECDI-SPs 的吞噬功能有明顯的上調(diào)。但由于品系以及供體的復(fù)雜性，，我們進(jìn)一步對(duì)基因敲除小鼠的選擇以及對(duì)照組的挑選進(jìn)行了改進(jìn)，選取 Cre+的條件敲除小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，以同窩繁殖的 Cre-的條件敲除小鼠腹腔
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2608174