發(fā)布時間：2020-03-28 10:25

【摘要】：目的:小RNA SbfR是本課題組通過Solexa高通量測序技術首次在傷寒沙門菌中發(fā)現(xiàn)的一個非編碼RNA,相關分子特性分析結果顯示,SbfR可能是一反式編碼RNA。本論文旨在初步探索SbfR在傷寒沙門菌中發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用和機制,為后續(xù)研究SbfR靶基因及作用機制奠定基礎。方法:1.傷寒沙門菌轉(zhuǎn)錄組分析:將SbfR缺陷株(ΔSbfR+p BAD)和SbfR回補株(ΔSbfR+p BAD-SbfR)培養(yǎng)至對數(shù)期(OD600≈0.4),加入L-阿拉伯糖誘導后提取細菌總RNA,加入熒光素進行逆轉(zhuǎn)錄,標記后的c DNA與全基因組芯片雜交,掃描并進行數(shù)據(jù)分析,比較SbfR缺陷株和回補株基因表達譜差異。選擇部分差異表達基因進行q RT-PCR,驗證基因芯片結果。2.q RT-PCR分析基因表達:分別提取各菌株總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為c DNA,進行q RT-PCR實驗,檢測基因的m RNA水平。3.細菌在不同溫度下的生長曲線測定:分別在37°C和42°C培養(yǎng)SbfR缺陷株和回補株,每隔1h檢測OD600值,以OD600數(shù)值作縱坐標,以時間作橫坐標,繪制SbfR缺陷株和回補株的生長曲線,比較SbfR對細菌在兩種溫度下生長情況的影響。4.SbfR片段分部回補株構建:分別構建連有SbfR前69nt和后69nt片段的重組載體,所用質(zhì)粒為p BAD/Myc-His A,并將重組載體電轉(zhuǎn)入ΔSbfR,制備前69nt和后69nt SbfR片段回補株。5.細菌動力實驗:將空載體株(WT+p BAD)、SbfR缺陷株、SbfR回補株及SbfR片段分部回補株分別培養(yǎng)至對數(shù)期,用接種針蘸取菌液點種于LB半固體動力板,置于37°C孵箱過夜,測量細菌圈直徑,分析SbfR對細菌動力的影響。6.Western-blot檢測Flj B表達水平:將空載體株、SbfR缺陷株和SbfR回補株培養(yǎng)至對數(shù)期,收集全菌蛋白,用兔抗Flj B抗血清進行Western-blot實驗,檢測各菌株Flj B表達水平。7.He La細胞侵襲實驗:將空載體株、SbfR缺陷株和SbfR回補株培養(yǎng)至對數(shù)期,與He La細胞共孵育90min,棄去培養(yǎng)液。一半細胞孔中加入Triton裂解細胞,涂板培養(yǎng),計數(shù)菌落數(shù)為粘附水平;一半細胞孔中加入慶大霉素培養(yǎng)90min后,加入Triton裂解細胞,涂板培養(yǎng),計數(shù)菌落數(shù)為侵襲水平。8.生物膜形成實驗:在TSB培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)空載體株、SbfR缺陷株、SbfR回補株及SbfR片段分部回補株至對數(shù)期,轉(zhuǎn)種至96孔板,30°C靜置4天,洗去浮游細菌并用結晶紫對生物膜染色,30%冰醋酸洗脫后595nm比色測定。結果:1.基因芯片分析結果顯示,SbfR缺陷株與回補株之間共99個基因表達水平存在差異;q RT-PCR結果與基因芯片分析數(shù)據(jù)相比,基因變化趨勢一致。2.生長曲線測定結果表明,在37°C條件下SbfR缺陷株與回補株的生長情況一致,而在42°C條件下回補株的生長明顯慢于缺陷株。3.成功構建SbfR前69nt片段和后69nt片段的回補株(ΔSbfR+p BAD-F69,ΔSbfR+p BAD-L69)。4.動力實驗結果表明,與空載體株相比,SbfR缺陷株動力下降,回補株動力恢復;兩部分SbfR片段回補株動力均恢復到空載體株水平,且與SbfR全長回補株動力水平一致。5.與空載體株相比,SbfR缺陷株Flj B表達水平下降,回補株Flj B表達水平恢復。6.與空載體株相比,SbfR缺陷株對He La細胞的侵襲能力下降,回補株的侵襲能力恢復。7.與空載體株相比,SbfR缺陷株的生物膜形成能力下降,回補株的形成能力恢復。兩部分SbfR片段回補株生物膜形成能力均部分恢復,與空載體株水平一致,但比SbfR全長回補株弱。8.SbfR缺陷株hsl S、hsl T、htp G、fli A、flj B、sop E等基因的轉(zhuǎn)錄水平低于SbfR回補株;flh D的轉(zhuǎn)錄水平高于SbfR回補株;prg J、fim A、csg A、yih P、rfa D、bcs A、wca A、bap A等基因的轉(zhuǎn)錄水平與SbfR回補株的差異無統(tǒng)計學意義。結論:sRNA SbfR參與傷寒沙門菌熱應激條件下生長、動力、侵襲、生物膜形成等方面的調(diào)節(jié),抑制熱應激條件下細菌生長,促進細菌動力、侵襲和生物膜形成能力。SbfR前69nt和后69nt回補株均可獨立完成全長SbfR對細菌動力的促進作用,但在形成生物膜能力方面兩種部分回補株分別發(fā)揮全長SbfR的部分調(diào)控作用。
【圖文】：

傷寒沙門菌小 RNA SbfR 相關功能研究穩(wěn)態(tài)期表達量較高；酸應激條件下，SbfR 表達上調(diào)，氧應激條件下，，表達量下調(diào)[54,55]。但是 SbfR 在 S. Typhi 中發(fā)揮的作用有待進行深入研究。

傷寒沙門菌小 RNA SbfR 相關功能研究3 實驗結果3.1 基因芯片3.1.1 SbfR 缺陷株與 SbfR 回補株雙色熒光疊加圖將兩張基因芯片的掃描結果經(jīng)計算機處理，數(shù)據(jù)疊加后產(chǎn)生圖像，如圖3.1。在A 圖中，綠色表示該基因在缺陷株中轉(zhuǎn)錄水平比回補株低，紅色表示該基因在缺陷株中轉(zhuǎn)錄水平比回補株高。B 圖與 A 圖相反，綠色表示該基因在缺陷株中轉(zhuǎn)錄水平比回補株高，紅色表示該基因在缺陷株中轉(zhuǎn)錄水平比回補株低。黃色點為綠色熒光和紅色熒光的中和效果，表明該基因在SbfR 缺陷株和回補株中的表達豐度相似。
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R378.22

【參考文獻】

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1 王哲鑫;吉瀅;趙昕;徐順高;黃新祥;;非編碼小RNA T64對傷寒沙門菌基因表達的影響[J];江蘇大學學報(醫(yī)學版);2014年04期

2 郭志燕;周明旭;段強德;朱國強;;細菌鞭毛的致病性及其免疫學應用的研究進展[J];微生物學報;2014年03期

本文編號：2604322