MiR-101a表觀調(diào)控Cox-2基因表達及軟骨發(fā)育的相關性研究

發(fā)布時間：2020-03-28 04:41

【摘要】：MicroRNAs是內(nèi)源性的干擾體內(nèi)蛋白生成的非編碼RNAs,可抑制m RNA翻譯為蛋白質(zhì)的過程同時也可以調(diào)節(jié)m RNA的穩(wěn)定性,從而成為了調(diào)控基因表達的關鍵因素。近年來的研究發(fā)現(xiàn),micro RNAs中的一個關鍵的成員mi R-101在哺乳動物體內(nèi)的正常生理(如血管的生成,受精卵的著床)以及病理狀態(tài)下(如實體瘤的發(fā)生發(fā)展和關節(jié)炎的進程中)均起到非常關鍵的作用。本綜述將著重討論micro RNA如何通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子,信號通路蛋白,表觀遺傳調(diào)控過程的關鍵蛋白因子以及體內(nèi)的一些關鍵酶類來發(fā)揮其生物學效應。通過以上的綜述將幫助我們系統(tǒng)地了解mi R-101在體內(nèi)生理病理狀態(tài)下發(fā)揮作用的方式,從而為今后mi R-101可能的臨床應用提供科學依據(jù)。研究背景:軟骨內(nèi)骨形成被認為是人體內(nèi)長骨或四肢骨發(fā)生的重要形式,在這一過程中靜息的軟骨細胞不斷增殖,同時伴隨著II型膠原和蛋白聚糖的積累,最后軟骨細胞在相關轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控下轉(zhuǎn)變?yōu)榉蚀筌浌羌毎⑼瑫r積累X型膠原蛋白。軟骨細胞的肥大伴隨而來的是肥大時期相關的基因如Col10a1、Cox-2和Mmp-13等表達量增高。環(huán)氧化酶2(Cox-2)是已知的機體受到相應刺激后快速產(chǎn)生的一種誘導酶,具有廣泛生理作用。本實驗室此前的研究表明,Cox-2表達增高促進軟骨細胞向肥大方向分化,這主要是通過調(diào)控肥大軟骨的相關標記基因如Col10a1實現(xiàn)的。研究目的:(1)探究mi R-101a mimic和inhibitor干預后對肥大期MCT和ATDC5軟骨細胞肥大相關基因Col10a1、Cox-2以及Mmp-13的作用,同時探索mi R-101a mimic和inhibitor干預后對于軟骨細胞肥大化進程的影響。(2)探索mi R-101a mimic和inhibitor干預后在增殖期MCT和ATDC5中對軟骨細胞增殖情況的影響。(3)探究mi R-101a調(diào)控軟骨細胞發(fā)育過程的潛在機制。研究方法:(1)運用Targetscan,Mi Randa網(wǎng)站在線預測Cox-2和Col10a1的3’UTR區(qū)域是否存在mi R-101a的結(jié)合位點。通過熒光素酶報告基因?qū)嶒灧治?確認mi R-101a與Col10a1、Cox-2的3’UTR區(qū)域的結(jié)合位點。(2)隨著培養(yǎng)條件的改變,兩株軟骨細胞模型由增殖期向肥大期的轉(zhuǎn)化。應用熒光定量PCR技術,在小鼠MCT和ATDC5兩株細胞系檢測兩個時期Col10a1、Cox-2和mi R-101a的表達情況。(3)通過瞬時轉(zhuǎn)染MCT細胞和慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ATDC5細胞得到mi R-101a mimic和inhibitor干預細胞模型;并應用熒光定量PCR技術、免疫印跡技術(WB)、Ed U細胞增殖成像技術和細胞染色技術來探討mi R-101a mimic和inhibitor干預后對軟骨細胞增殖和肥大化進程的影響。(4)應用Pathway Builder Tool2.0(www.proteinlounge.com)軟件繪制簡單的基因相互作用結(jié)構(gòu)圖譜來闡釋mi R-101a與一些肥大軟骨時期相關基因的關系網(wǎng)絡圖。研究結(jié)果:(1)生物信息學網(wǎng)站預測結(jié)果顯示mi R-101a與Cox-2、Col10a1的3’UTR區(qū)域存在結(jié)合位點。進一步地,相應報告基因的分析結(jié)果顯示mi R-101a與Cox-2的3’UTR區(qū)域存在結(jié)合,然而與Col10a1的3’UTR區(qū)域不存在明顯結(jié)合。(2)熒光定量PCR的結(jié)果顯示:與增殖期的MCT和ATDC5細胞相比,軟骨細胞肥大時期相關基因Col10a1、Cox-2呈現(xiàn)高表達狀態(tài),而mi R-101a基因表達降低。(3)在MCT和ATDC5細胞中mi R-101a mimic干預后,結(jié)果顯示mi R-101a抑制軟骨肥大相關基因的表達;在MCT和ATDC5細胞中mi R-101a inhibitor干預后,結(jié)果顯示軟骨肥大相關基因表達增高。在兩株軟骨細胞中mi R-101a mimic和inhibitor干預后對Sox9和Runx2基因表達沒有產(chǎn)生明顯影響。(4)Ed U細胞增殖成像和阿爾新藍染色結(jié)果顯示mi R-101a mimic干預后可抑制軟骨細胞的增殖,mi R-101a inhibitor干預后可促進軟骨細胞增殖。研究結(jié)論:生物信息學預測Cox-2與Col10a1基因3’UTR存在mi R-101結(jié)合位點,進一步地熒光素酶報告基因?qū)嶒灡砻鱩i R-101a只與Cox-2的3’UTR區(qū)域存在結(jié)合作用。Mi R-101a可能通過調(diào)節(jié)靶基因Cox-2,調(diào)控基因表達并在軟骨發(fā)育時期發(fā)揮了重要作用。
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