【摘要】：丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)主要通過血液途徑感染肝臟,引起急性及慢性病毒性肝炎。目前全球約有1.7~2億人感染HCV,我國健康人群HCV抗體陽性率為0.7%~3.1%。大多數(shù)HCV感染易演變?yōu)槁愿腥?部分HCV慢性感染可進(jìn)展為肝硬化及肝細(xì)胞癌。HCV感染已成為危害健康的嚴(yán)重問題。聚乙二醇α干擾素(pegylated interferon-α,PEG-IFN-α)聯(lián)合利巴韋林(ribavirin,RBV)是目前抗HCV感染的經(jīng)典治療方案,但由于IFN嚴(yán)重的毒副作用、不同HCV基因型敏感性不同、干擾素抵抗等多種因素限制了其療效及使用范圍。近年來,隨著對HCV不斷深入的研究,抗HCV治療方面取得較大成果,如抗HCV的小分子藥物蛋白酶抑制劑--直接抗病毒藥物(direct-acting antiviral agents,DAAs)的臨床應(yīng)用,相較于聯(lián)合療法持續(xù)性病毒學(xué)應(yīng)答(sustained virological response,SVR)明顯提高。但由于HCV基因型多、易變異且DAA治療費用昂貴等應(yīng)用受限,且近期有報道DAAs可能會增加肝細(xì)胞癌的發(fā)病率及術(shù)后復(fù)發(fā)。因此,對HCV感染相關(guān)宿主因子的探索及靶向抗HCV治療仍是目前HCV研究的熱點。HCV是單股正鏈RNA病毒,為黃病毒屬成員,多個宿主因子被報道參與包括入侵、復(fù)制、組裝和釋放等在內(nèi)的復(fù)制周期。microRNAs(miRNAs)是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA。大量研究表明,miRNAs可參與調(diào)控細(xì)胞分化、增殖、凋亡、代謝、細(xì)胞周期等多個環(huán)節(jié),并與炎癥性、感染性、代謝性疾病及腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),其主要生物學(xué)功能是通過與其靶標(biāo)分子的3’-UTR結(jié)合來抑制翻譯或降解mRNA,進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)。多種miRNAs已被證實在HCV誘導(dǎo)的肝癌(HCV-HCC)的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。miRNAs在HCV的復(fù)制、診斷、治療中同樣扮演重要角色。例如,研究發(fā)現(xiàn)miR-122及miR-141具有促進(jìn)HCV復(fù)制的作用,miR-122的小分子互補(bǔ)拮抗劑Miravirsen(SPC3649)目前已進(jìn)入III期臨床試驗階段。細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制分子3(SOCS3)是SOCS家族的重要分子之一,大量研究表明SOCS3在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用�，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)SOCS3可以負(fù)性調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子和激素(包括IL-6、IL-10、IFN-α、LPS、瘦素、胰島素等)產(chǎn)生的信號傳導(dǎo),從而在炎癥、感染及腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。SOCS3在病毒感染中的作用主要與其可負(fù)性調(diào)節(jié)酪氨酸蛋白激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription,JAK-STAT)通路有關(guān),而JAK-STATs通路是Ⅰ型和Ⅱ型IFN發(fā)揮抗病毒作用的信號通路。SOCS3的表達(dá)與HCV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制程度密切相關(guān)。已有研究表明,HCV患者肝樣本中SOCS3蛋白表達(dá)增加,而高水平SOCS3表達(dá)與HCV患者IFN治療抵抗相關(guān)。同時,肝細(xì)胞SOCS3水平可反應(yīng)HCV感染IFN治療的效果。SOCS3基因的多態(tài)性與宿主對抗病毒治療的反應(yīng)相關(guān)。已有報道表明SOCS3是HCV在體內(nèi)復(fù)制中重要的宿主因子之一,近年來的研究表明多種miRNA可通過調(diào)節(jié)SOCS3的表達(dá)而影響多種疾病的發(fā)生發(fā)展,但鮮有靶向SOCS3的miRNAs對HCV復(fù)制及IFN抗HCV作用的影響�；赟OCS3在HCV復(fù)制中的重要作用,本課題探討了靶向SOCS3的miRNAs對HCV復(fù)制及IFN抗HCV作用的影響。本研究中,我們首先通過SOCS3的siRNA驗證了SOCS3在細(xì)胞水平對HCV復(fù)制的影響:將si-SOCS3及si-NC轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞,相較于si-NC,si-SOCS3除可抑制HCV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制,IFN-α還可進(jìn)一步增強(qiáng)si-SOCS3對HCV復(fù)制的抑制作用。進(jìn)而,以mimicNC(mNC)作為陽性對照,通過轉(zhuǎn)染miRNA mimic模擬miRNA在細(xì)胞內(nèi)的過表達(dá),證實了miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p對SOCS3具有明顯的抑制作用。進(jìn)一步的實驗中,構(gòu)建含有SOCS3 3’-UTR(WT)及miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p與SOCS3 3’-UTR結(jié)合位點突變的質(zhì)粒,利用雙熒光素酶報告基因驗證了SOCS3是miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p的靶標(biāo)分子。在此基礎(chǔ)上,通過利用HCVcc感染,在細(xì)胞模型上證實了miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p在抑制HCV復(fù)制的同時也抑制了SOCS3的表達(dá)。而在用IFN-α處理后,miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p對HCV復(fù)制的抑制作用進(jìn)一步加強(qiáng)。以往的研究已證實SOCS3是JAK-STATs通路重要的負(fù)性調(diào)節(jié)因子之一,而IFN-α抗HCV的作用正是通過作用于JAK-STATs通路,IFN-α上調(diào)該通路下游p-STAT1的表達(dá)發(fā)揮其抗HCV的作用。因此,我們分別轉(zhuǎn)染si-SOCS3、miR-185-5p mimic、miR-19b-3p mimic、miR-30c-5p mimic及對照,結(jié)果發(fā)現(xiàn),相較于對照,si-SOCS3、miR-185-5p mimic、miR-19b-3p mimic及miR-30c-5p mimic均可明顯上調(diào)p-STAT1的表達(dá),從而進(jìn)一步證實了IFN-α增強(qiáng)靶向SOCS3的miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p抑制HCV復(fù)制的作用是通過共同加強(qiáng)JAK-STATs通路作用而實現(xiàn)的。基于上述發(fā)現(xiàn),靶向SOCS3的miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p可在細(xì)胞模型中抑制HCV復(fù)制,其作用是通過互補(bǔ)結(jié)合SOCS3 mRNA的3’-UTR抑制了SOCS3蛋白的表達(dá)。這一抑制作用解除或削弱了SOCS3對JAK-STAT通路的負(fù)性調(diào)節(jié)作用,明顯上調(diào)了p-STAT1的表達(dá),而p-STAT1是IFN-α發(fā)揮抗HCV效應(yīng)的中介因子之一。因此,靶向SOCS3的miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p表現(xiàn)出抑制HCV復(fù)制及協(xié)同IFN-α抗HCV的作用。該研究有助于將SOCS3作為對IFN治療反應(yīng)的標(biāo)志物提供更多的證據(jù),同時為研發(fā)基于SOCS3的潛在療法奠定基礎(chǔ),為拓寬IFN治療HCV感染提供更多依據(jù)。
【圖文】：

si-SOCS3對Huh7細(xì)胞中SOCS3表達(dá)的影響

圖 2. si-SOCS3 對 HCV mRNA 和蛋白表達(dá)的影響Figure 2. Effects of si-SOCS3 on HCV mRNA and protein exCS3 mRNA expression is downregulated by si-SOCS3 detec.01). B. HCV mRNA expression is downregulated by si-SO
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R373.21

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本文編號：2601964