發(fā)布時間：2020-03-22 06:35

【摘要】：目的:明確凋亡相關蛋白3(apoptosis related protein 3,APR3)的亞細胞學定位,并探討其在細胞凋亡和自噬中的作用。方法:采用生物信息學方法對APR3蛋白的信號肽、跨膜區(qū)、糖基化情況進行預測,并采用Real-time PCR和Western blot檢測APR3在小鼠各器官組織及多種細胞株中的表達。利用Percoll法蔗糖密度梯度離心技術獲得小鼠肝臟組織溶酶體組份,并進行Western blot分析,檢測APR3蛋白與溶酶體膜標記蛋白LAMP1在各亞細胞組份及溶酶體中的豐度;采用免疫熒光共聚焦方法探討APR3與LAMP1或溶酶體示蹤劑Lyso-Tracker Red共同定位情況,以及構建的APR3蛋白真核表達載體(pFUGW-APR3)表達的外源性APR3蛋白的亞細胞定位特征。APR3表達載體(pFUGW-APR3)和沉默載體(pLL3.7-APR3)轉染NIH 3T3細胞,采用CCK-8和xCELLigence活細胞計數法、碘化丙啶染色細胞流式細胞術等,檢測APR3對細胞增殖活力、細胞周期、細胞溶酶體膜通透性、溶酶體腔pH、溶酶體腔多種酸性水解酶活性(如組織蛋白酶、酸性磷酸酶、酸性脂酶和β-半乳糖苷酶等)等的影響;采用流式細胞術檢測細胞凋亡情況,采用透射電鏡技術檢測細胞形態(tài)的變化;采用Western blot法檢測APR3對凋亡相關蛋白BAX、BAD、BCL-2和cleaved caspase 3表達的影響,以及自噬相關標記蛋白Beclin1和Map1LC3B表達的影響;利用小劑量Rapamycin刺激后,觀察APR3蛋白對phos-mTOR和p62蛋白表達的影響。結果:生物信息學預測結果顯示APR3是一個含有信號肽、單重跨膜的糖基化蛋白,Real-time PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)其在多種組織器官和細胞株中均有表達,其中在小鼠脾臟、腎臟、肝臟、肺、脂肪組織和部分腫瘤細胞株中具有相對較高的表達。對亞細胞器組份的Western blot檢測發(fā)現(xiàn)APR3蛋白與LAMP1蛋白表達具有高度的重疊,免疫熒光雙染色結果也顯示APR3和LAMP1具有相同的細胞學定位特征,并且與溶酶體示蹤劑Lyso-Tracker Red具有相同的細胞器定位;NIH 3T3細胞轉染外源表達質粒后免疫熒光染色顯示外源性APR3與Lyso-Tracker Red具有相同的細胞器定位,并且出現(xiàn)部分定位失真現(xiàn)象,即在細胞膜中亦出現(xiàn)表達。NIH 3T3細胞株中外源性APR3蛋白過表達降低細胞的增殖活力,細胞出現(xiàn)細胞周期阻滯,阻滯于G1/S期,同時伴細胞周期蛋白cyclin D1表達下降,細胞凋亡促進因子BAX、BAD和cleaved caspase 3表達升高,凋亡抑制因子BCL-2表達下調,自噬相關標記蛋白Beclin-1和Map1LC3B表達增加;外源性APR3蛋白過表達還使細胞溶酶體膜通透性增加,溶酶體腔pH降低,溶酶體腔組織蛋白酶B、酸性磷酸酶、酸性脂酶和β-半乳糖苷酶活性增加;與此相反,APR3基因沉默則使溶酶體膜通透性顯著下降,溶酶體腔pH升高,但不影響溶酶體腔相關酶活性;小劑量Rapamycin使APR3過表達細胞凋亡和自噬相關標記蛋白的表達發(fā)生進一步變化(BAX升高、BCL-2下降、Beclin 1和Map1LC3B表達增加),伴隨著Phos-mTOR和p62蛋白表達的進一步下降。結論:APR3蛋白是一個定位于溶酶體膜的全膜蛋白;APR3蛋白過表達導致細胞增殖活力下降,cyclin D1表達下降和細胞周期阻滯(G1/S期),細胞凋亡與自噬增多,并對Rapamycin的敏感性增加。
【圖文】：

通大學博士學位論文 APR3 蛋白的亞細胞學定位及其在細胞凋亡和自噬中信號肽預測利用 expasy 信息分析工具獲得信號肽預測效果，如圖 1-1 所示。asure Position Value Cutoff signal peptide?x. C 26 0.628x. Y 26 0.700x. S 22 0.876an S 1-25 0.768D 1-25 0.737 0.450 YES=Sequence SP='YES' Cleavage site between pos. 25 and 26: ALA-LP D=0toff=0.450 Networks=SignalP-noTM、結果R3的生物信息學分析

圖 1-2. APR3 蛋白跨膜區(qū)分析Figure 1-2. Analysis transmembrane region of APR3 protein由圖 1-2 分析表明，，APR3 顯示有 2 個跨膜區(qū)，定位于膜上。其跨膜序于“FSLLMFFGILGSTTLAISILLWG”氨基酸序列中。糖基化分析tput for ' NM_027855.3' NM_027855.3 Length: 223SGGSRAAALLLVLGVERALALPEICTLCPGGMHNLSRVAAYCEDTSKLMQARCCLNQKGTILGLDLQNCSLKDPG 8AYTAIIIDLQANPLKDDLANTFRGFTQLQTLILPQDVPCPGGSNAWDNVTSFKDKQICQGQRDLCNSTGSPEMCP 16ASDGPGLLQCVCADGFHGYKCMRQGSFSLLMFFGILGSTTLAISILLWGTQRRKAKAS.................................N.................................N....... 8...............................................N........................... 16.......................................................... 24shold=0.5)
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2;Q811.4

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