發(fā)布時(shí)間：2020-03-21 15:08

【摘要】：目的:人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)是引起人類(lèi)獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的病原體。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù),HIV的早期診斷對(duì)控制其傳播有著至關(guān)重要的意義。本研究采用級(jí)聯(lián)的toehold介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)(TMSDR)和非酶的目標(biāo)物循環(huán)擴(kuò)增(TRA)實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大,構(gòu)建雙信號(hào)電化學(xué)生物傳感系統(tǒng)對(duì)HIV相關(guān)基因進(jìn)行高靈敏特異性檢測(cè),以期實(shí)現(xiàn)對(duì)HIV進(jìn)行早期診斷。方法:1.電化學(xué)生物傳感檢測(cè)系統(tǒng)的構(gòu)建和表征:以目標(biāo)鏈促發(fā)級(jí)聯(lián)的toehold介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)同時(shí)啟動(dòng)非酶的目標(biāo)物循環(huán)以期實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大,以聚丙烯酰胺凝膠電泳(PEAG)、熒光分光光度法、電化學(xué)阻抗譜法(EIS)對(duì)設(shè)計(jì)的方法和傳感器的組裝進(jìn)行可行性分析和表征。2.電化學(xué)生物傳感檢測(cè)系統(tǒng)的條件優(yōu)化:對(duì)影響檢測(cè)的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,主要包括檢測(cè)探針的濃度和固定時(shí)間、反應(yīng)物的比例、反應(yīng)時(shí)間和溫度等。3.電化學(xué)生物傳感檢測(cè)系統(tǒng)的性能評(píng)價(jià):以方波伏安法(SWV)作為電化學(xué)檢測(cè)方法,對(duì)傳感器的線(xiàn)性檢測(cè)范圍、靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度以及重復(fù)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果:1.通過(guò)不同方法證明設(shè)計(jì)的方法具有可行性,傳感器成功構(gòu)建。2.基于TMSDR和非酶的TRA的電化學(xué)生物傳感系統(tǒng),其線(xiàn)性檢測(cè)范圍為1 pM到10 nM,檢測(cè)低限為0.88 pM(S/N=3),具有較好的特異性能夠識(shí)別單堿基錯(cuò)配,準(zhǔn)確度和重復(fù)性亦較為優(yōu)異。結(jié)論:本研究構(gòu)建了一種電化學(xué)DNA生物傳感器用于高靈敏特異性地檢測(cè)HIV相關(guān)基因。本研究構(gòu)建的傳感器具有雙信號(hào)、非酶擴(kuò)增以及反應(yīng)條件溫和的特點(diǎn)。級(jí)聯(lián)的鏈置換反應(yīng)和雙重氧化還原標(biāo)簽的雙信號(hào)識(shí)別保證了方法的特異性能夠識(shí)別單堿基錯(cuò)配。在稀釋的人血清中亦表現(xiàn)出了很好的檢測(cè)能力,說(shuō)明其具有在復(fù)雜樣本中進(jìn)行檢測(cè)的能力。再者,通過(guò)改變檢測(cè)探針的序列,可以對(duì)其它核酸進(jìn)行檢測(cè),故其在核酸檢測(cè)方面具有較好的應(yīng)用潛力和價(jià)值。
【圖文】：

并暴露出 5'末端作為 toehold 區(qū)域與 target 進(jìn)行雜交。當(dāng)有 target 存在的其與 CS 的 5'末端的 toehold 區(qū)域雜交，TMSDR 促發(fā)核酸鏈的分支遷移，BS 置換下來(lái)。隨后，trigger 與 CS 的中間區(qū)域雜交，同樣通過(guò) DNA 的，MB-AS 和 target 均被置換下來(lái)，釋放的 target 啟動(dòng)新一輪反應(yīng)形成了放大的機(jī)制。循環(huán)放大機(jī)制促使大量帶有信號(hào)基團(tuán)的 MB-AS 釋放，以敏檢測(cè)。MB 和 Fc 作為具有電活性的氧化還原標(biāo)簽在該生物感應(yīng)體系signal-off/on”電化學(xué)信號(hào)（如圖 1B）。首先，F(xiàn)c-P1 / P2 雙鏈 DNA 檢過(guò) Au-S 鍵自組裝在金電極的表面。由于 Fc 信號(hào)基團(tuán)靠近電極表面，故的電流信號(hào)較強(qiáng)。當(dāng) MB-AS 將 Fc-P1 置換下來(lái)形成 MB-AS / P2 雙鏈時(shí)信號(hào)基團(tuán)遠(yuǎn)離電極，信號(hào)減小，同時(shí) MB 信號(hào)基團(tuán)靠近電極，信號(hào)增大個(gè)信號(hào)基團(tuán)總變化值與 target 濃度的相關(guān)性進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)產(chǎn)生兩個(gè)氧流信號(hào)使得檢測(cè)精確且靈敏，可顯著提高方法的檢測(cè)性能。

核酸傳感檢測(cè)系統(tǒng)的表征光光度法表征實(shí)驗(yàn) target 置換下來(lái)，BS 又可將帶有 FAM 基團(tuán)的 P3 從光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)遠(yuǎn)離，熒光恢復(fù)。圖 2 中 a 曲線(xiàn)，S混合液，其熒光強(qiáng)度較弱，表明 FAM 基團(tuán)被 Dabcyl 和熒光探針的混合液中加入 trigger 后，因?yàn)楸尘靶盘?hào) 曲線(xiàn), 在 SP 和熒光探針的混合液中加入 target 以后，的增幅，，說(shuō)明 target 將 BS 置換了下來(lái)；d 曲線(xiàn),在 SP 入了 target 和 trigger 后，熒光強(qiáng)度較 b 曲線(xiàn)上升了 550充分說(shuō)明了無(wú)酶的 TRA 和 trigger 對(duì)于信號(hào)放大的重要
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R373;TP212

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本文編號(hào)：2593515