【摘要】：背景:帕金森病是多發(fā)于中老年人群的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一,該病主要病機(jī)為中腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元變性或壞死,進(jìn)而導(dǎo)致黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元含量減少。目前國內(nèi)外針對帕金森病患者的治療與試驗(yàn)研究已引起廣大科研人員的高度重視,然而國內(nèi)對帕金森病的研究仍主要停留在動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)階段,因此建立穩(wěn)定可靠的帕金森病動(dòng)物模型成為深入研究帕金森病的基礎(chǔ)。在治療帕金森病方面,人類一直致力于尋找有效的治療途徑,目前仍以藥物治療為主,代表性藥物為左旋多巴,其次就是手術(shù)和生物制劑治療。但是隨著干細(xì)胞研究在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的迅猛發(fā)展,干細(xì)胞移植開始應(yīng)用于帕金森病的治療,為帕金森病的治療帶來了新的曙光。近些年,針對各種干細(xì)胞移植治療帕金森病的研究相繼開展,尋求一種相對有效的治療途徑成為研究的焦點(diǎn)�；谝陨媳尘�,本研究分別嘗試移植大鼠神經(jīng)干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞治療帕金森病大鼠模型,探究移植細(xì)胞的存活和分化情況,通過比較,評價(jià)移植效果,探索細(xì)胞移植治療帕金森病的有效途徑。目的:(1)建立相對理想的帕金森病動(dòng)物模型。(2)掌握細(xì)胞移植技術(shù),探索細(xì)胞移植治療帕金森病大鼠的有效性與可行性。方法:本實(shí)驗(yàn)以成年雄性SD大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,使用腦立體定位儀,采用6-羥多巴胺兩點(diǎn)注射右側(cè)內(nèi)側(cè)前腦束的方法,制備單側(cè)損毀帕金森病(PD)大鼠模型。通過阿撲嗎啡(APO)誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)對PD大鼠模型行為學(xué)進(jìn)行鑒定,通過曠場實(shí)驗(yàn)和露臺水迷宮實(shí)驗(yàn)對大鼠行為學(xué)進(jìn)行檢測。培養(yǎng)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)和大鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs),觀察細(xì)胞生長、增殖、分化情況,對細(xì)胞特性進(jìn)行鑒定和檢測。收集生長狀態(tài)較好的細(xì)胞進(jìn)行移植,移植后分別從行為學(xué)和病理學(xué)方面評價(jià)移植效果。結(jié)果:(1)成功建立單側(cè)兩點(diǎn)損毀帕金森病大鼠模型,建模成功率高達(dá)60%以上,在術(shù)后兩個(gè)月內(nèi),成功模型的數(shù)量不斷增加,成功率逐漸上升。6-OHDA單側(cè)兩點(diǎn)注射內(nèi)側(cè)前腦束建模的方法具有穩(wěn)定性好、成功率高的特點(diǎn)。(2)NSCs培養(yǎng)結(jié)果顯示:細(xì)胞呈球狀懸浮生長,細(xì)胞逐漸聚集增大,形成神經(jīng)球,隨后逐漸凋亡。在細(xì)胞生長狀態(tài)良好的情況下,酪氨酸羥化酶(TH)鑒定為陽性。(3)iPSCs培養(yǎng)結(jié)果顯示:iPSCs復(fù)蘇后第4天開始換液,在第5天左右生長狀態(tài)最好,表面特征性抗原及標(biāo)記基因鑒定呈陽性。(4)行為學(xué)結(jié)果顯示:與正常組相比,模型組、細(xì)胞移植組大鼠在曠場實(shí)驗(yàn),露臺水迷宮實(shí)驗(yàn)中行為學(xué)表現(xiàn)均存在顯著性差異(P0.01);NSCs移植組與模型組大鼠相比,在曠場實(shí)驗(yàn),露臺水迷宮實(shí)驗(yàn)中行為學(xué)表現(xiàn)差異極其顯著(P0.01)。iPSCs移植組與模型組大鼠相比,行為學(xué)表現(xiàn)具有明顯差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但治療效果不及神經(jīng)干細(xì)胞移植組。(5)病理學(xué)檢測結(jié)果顯示:細(xì)胞移植后第三周,與模型組相比,NSCs移植組大鼠右側(cè)黑質(zhì)區(qū)TH陽性表達(dá)量明顯增多,部分神經(jīng)元胞體形態(tài)逐漸恢復(fù)正常,神經(jīng)元數(shù)量顯著增加;與正常組相比,NSCs移植組、模型組大鼠右側(cè)黑質(zhì)區(qū)TH陽性表達(dá)量明顯減少,神經(jīng)元胞體形態(tài)發(fā)生變化,神經(jīng)元數(shù)量明顯減少。(6)Western Blot檢測結(jié)果顯示:NSCs移植組大鼠在細(xì)胞移植后第三周與第一周相比,TH蛋白濃度呈增高趨勢,蛋白相對表達(dá)量明顯增多,差異顯著(P0.01)。結(jié)論:(1)本研究中,6-羥多巴胺兩點(diǎn)注射右側(cè)內(nèi)側(cè)前腦束制備偏側(cè)損毀PD大鼠模型是一種高效的建模方法,所建PD大鼠模型穩(wěn)定,適合用于開展帕金森疾病的干細(xì)胞移植與治療。(2)NSCs移植治療帕金森病大鼠模型,在細(xì)胞移植后三周內(nèi)具有較好的改善效果;而iPSCs移植治療帕金森病大鼠,在細(xì)胞移植后三周內(nèi)具有一定的改善效果,但改善效果不及神經(jīng)干細(xì)胞移植組,同時(shí)不同個(gè)體之間存在一定差異。
【圖文】：

神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)、增殖及鑒定 13.5 天的健康 SD 大鼠胚胎中腦組織中分離出的細(xì)胞進(jìn)行懸液培養(yǎng)第一天，絕大多數(shù)呈單細(xì)胞狀態(tài)，邊界清楚，隨著細(xì)胞密度增加，成球狀，細(xì)胞間的結(jié)合程度更緊密，神經(jīng)球呈增大趨勢（見圖 1）。大量神經(jīng)球且生長狀態(tài)良好時(shí)，即可傳代。本實(shí)驗(yàn)選取傳 3 代后神h 后進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞特異性蛋白 Nestin 染色鑒定（見圖 2）。通過使用液（NID），可見神經(jīng)胚球向神經(jīng)細(xì)胞分化，，發(fā)散出神經(jīng)細(xì)胞狀分支過利用神經(jīng)元特異性抗原 TBR1 進(jìn)行免疫熒光檢測表明，可見明顯見圖 4）

A 為復(fù)蘇后第一天的 MEF；B 為復(fù)蘇后第 3 天的 MEF（100×）；C（白光）、D（綠色熒光）為復(fù)蘇后第 5 天的 iPSCs（100×）；A : MEF on the first day after resuscitation;B: MEF on day 3 after resuscitation;C (white light) and D (green fluorescence) are iPSCs on the fifth day after resusci
【學(xué)位授予單位】：蚌埠醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R742.5;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2591384