【摘要】：目的:闡明蛻膜巨噬細(xì)胞表面Tim-3在孕期弓形蟲感染致不良妊娠結(jié)局中的作用機(jī)制。方法:體外實(shí)驗(yàn):取人早孕期流產(chǎn)蛻膜組織標(biāo)本,分離蛻膜組織,制備單細(xì)胞懸液,磁珠分選純化獲得人蛻膜巨噬細(xì)胞,將其平均分為正常組、感染組和Tim-3抗體中和感染組,其中,感染組和Tim-3抗體中和感染組加入剛地弓形蟲RH株速殖子(細(xì)胞數(shù):蟲子數(shù)=1:2)感染24h。流式細(xì)胞術(shù)檢測各組蛻膜巨噬細(xì)胞表面Tim-3的表達(dá)水平、M1型功能分子(膜功能分子CD80、CD86,胞內(nèi)TNF-α)、M2型功能分子(膜功能分子CD163、CD209、CD206,胞內(nèi)IL-10)的表達(dá)水平。Western Blot技術(shù)檢測各組蛻膜巨噬細(xì)胞中精氨酸代謝酶iNOS和Arg-I的合成水平。ELISA方法檢測各組人蛻膜巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-10的水平。體內(nèi)實(shí)驗(yàn):建立弓形蟲感染致不良妊娠結(jié)局的C57BL/6野生型和Tim-3基因敲除(Tim-3-/-)的孕鼠模型,以未感染組孕鼠作為正常對照組,分為正常組、感染組和Tim-3-/-感染組,感染組和Tim-3-/-感染組分別于孕8天腹腔感染剛地弓形蟲RH株速殖子400條。于孕14天觀察并記錄各組孕鼠妊娠結(jié)局,包括孕鼠精神狀態(tài),活胎數(shù)、死胎數(shù)吸和收胎數(shù),胎鼠及胎盤重量,及其出血情況。將剝離的胎盤與子宮制備單細(xì)胞懸液,流式細(xì)胞術(shù)分別檢測各組蛻膜巨噬細(xì)胞表面Tim-3、M1型功能分子(膜功能分子CD80、CD86,精氨酸代謝酶iNOS,胞內(nèi)TNF-α)、M2型功能分子(膜功能分子CD206,精氨酸代謝酶Arg-I,胞內(nèi)IL-10)的表達(dá)水平。結(jié)果:體外實(shí)驗(yàn):流式檢測結(jié)果顯示,感染組人蛻膜巨噬細(xì)胞表面Tim-3表達(dá)水平較正常組明顯降低。流式結(jié)果顯示,感染組人蛻膜巨噬細(xì)胞表面M1型膜功能分子CD80、CD86表達(dá)水平較正常組明顯升高,而M2型膜功能分子CD163,CD209,CD206的表達(dá)水平明顯降低(P0.05)。Western Blot結(jié)果顯示,感染組人蛻膜巨噬細(xì)胞內(nèi)M1型精氨酸代謝酶iNOS表達(dá)明顯升高,而M2型精氨酸代謝酶Arg-I表達(dá)明顯降低(p0.05)。流式和ELISA檢測結(jié)果顯示,感染組人蛻膜巨噬細(xì)胞胞內(nèi)及培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-10的水平較正常組均升高,但TNF-α升高更為明顯,二者比值TNF-α/IL-10較正常組明顯升高(P＜0.05)。為驗(yàn)證蛻膜巨噬細(xì)胞表面Tim-3對以上功能分子的影響,在Tim-3抗體中和感染組中對以上功能分子進(jìn)行進(jìn)一步檢測。流式檢測結(jié)果顯示,與感染組相比,Tim-3抗體中和感染組M1型膜功能分子CD80、CD86表達(dá)水平明顯升高,而M2型膜功能分子CD163、CD209、CD206表達(dá)水平明顯降低(p＜ 0.05),Tim-3仍能檢測到少量表達(dá)。Western Blot結(jié)果顯示,人蛻膜巨噬細(xì)胞內(nèi)M1型精氨酸代謝酶iNOS表達(dá)明顯升高,而M2型精氨酸代謝酶Arg-I表達(dá)明顯降低(p0.05)。流式檢測結(jié)果顯示,蛻膜巨噬細(xì)胞胞內(nèi)TNF-α、IL-10的表達(dá)水平均降低,IL-10降低更為明顯,二者比值TNF-α/IL-10較感染組明顯升高(p＜ 0.05)。ELISA檢測結(jié)果顯示,蛻膜巨噬細(xì)胞胞培養(yǎng)上清中TNF-α IL-10的分泌水平均升高,TNF-α升高更為明顯,二者比值TNF-α/IL-10明顯升高(p0.05)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn):與正常組比,感染組弓形蟲感染后出現(xiàn)明顯不良妊娠結(jié)局,孕鼠出現(xiàn)萎靡不振,弓背,活動減少,胎鼠中活胎數(shù)明顯減少,胎鼠體積減小,重量減輕,有明顯的吸收胎和死胎,胎盤體積減小及其重量減輕,且胎盤四周有明顯出血。而Tim-3-/-感染組較感染組呈現(xiàn)更為嚴(yán)重的不良妊娠結(jié)局,孕鼠精神狀態(tài)更加萎靡,弓背、聳毛更加嚴(yán)重,胎鼠中出現(xiàn)更多的吸收胎和死胎,有的胎鼠甚至不成形,胎盤體積進(jìn)一步減小,重量進(jìn)一步減輕,出血更為嚴(yán)重。流式結(jié)果顯示,與正常組相比,感染組孕鼠蛻膜巨噬細(xì)胞表面Tim-3表達(dá)水平明顯降低,蛻膜巨噬細(xì)胞表面M1型膜功能分子CD80、CD86表達(dá)水平明顯升高,M2型膜功能分子CD206的表達(dá)明顯降低(p＜ 0.05):蛻膜巨噬細(xì)胞內(nèi)iNOS的表達(dá)水平較正常組明顯升高,而Arg-I則明顯降低,且Tim-3的表達(dá)水平與iNOS呈明顯負(fù)相關(guān),與Arg-I呈明顯正相關(guān)(p＜ 0.05);蛻膜巨噬細(xì)胞胞內(nèi)TNF-α的水平明顯升高,而IL-10的分泌則有所降低(p＜0.05),二者比值TNF-α/IL-10明顯升高(p0.05)。為進(jìn)一步探索弓形蟲感染所致以上功能分子的改變是否由Tim-3表達(dá)水平降低所引起,將Tim-3-/-感染組與感染組進(jìn)行比較,結(jié)果顯示,M1型膜功能分子CD80、CD86較感染組明顯升高,M2型膜功能分子CD206明顯降低(p0.05);蛻膜巨噬細(xì)胞內(nèi)合成iNOS水平較感染組明顯升高,而Arg-I的水平則明顯降低(p0.05);蛻膜巨噬細(xì)胞胞內(nèi)TNF-α的分泌水平較感染組明顯升高,IL-10的分泌也有所升高,但二者比值TNF-α/IL-10較感染組明顯升高(p0.05)。結(jié)論:孕期弓形蟲感染導(dǎo)致人和小鼠蛻膜巨噬細(xì)胞表面Tim-3表達(dá)水平明顯下降,Tim-3表達(dá)水平下降進(jìn)而可引起蛻膜巨噬細(xì)胞由M2型向M1型極化,M1型蛻膜巨噬細(xì)胞相關(guān)功能分子表達(dá)增加,對胚胎的殺傷功能增強(qiáng);M2型蛻膜巨噬細(xì)胞相關(guān)功能分子表達(dá)均明顯減少,母胎耐受功能減弱,這可能是孕期弓形蟲感染致不良妊娠結(jié)局發(fā)生的重要分子免疫機(jī)制。本研究初步闡明了蛻膜巨噬細(xì)胞表面抑制性分子Tim-3在孕期弓形蟲感染致不良妊娠結(jié)局中的作用機(jī)制,本研究結(jié)果為全面闡明孕期弓形蟲感染致不良妊娠結(jié)局的分子機(jī)制研究增添了新的內(nèi)容,也必將為尋找并建立有效預(yù)防和治療先天性弓形蟲的手段和方法奠定理論基礎(chǔ),對從根本上降低出生缺陷、提高出生人口質(zhì)量產(chǎn)生極其重要的意義。
【圖文】：

圖１．人蛻膜巨噬細(xì)胞表面Ｔｉｍ－３在正常組、感染組和Ｔｉｍ－３抗體中和感染組表達(dá)。逡逑流式細(xì)胞術(shù)檢測人蛻膜巨噬細(xì)胞表面Ｔｉｍ－３在正常組、感染組和Ｔｉｍ－３抗體中和感染組逡逑的表達(dá)水平改變。每組至少�。独肆鳟a(chǎn)標(biāo)本，數(shù)據(jù)以平均仉士標(biāo)準(zhǔn)差顯示，結(jié)果懫用非配逡逑對邋Ｔ邋檢驗(yàn)分析，Ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ邋：正常組，ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋：感染組邋ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｄ邋ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋：邋Ｔｉｍ－３邋抗體中逡逑

采用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ方法檢測各組人脫膜巨嗤細(xì)胞ｉＮＯＳ、Ａｒｇ－Ｉ表達(dá)。結(jié)果顯示：逡逑弓形蟲感染后，ｉＮＯＳ合成明顯升高，Ａｒｇ－丨合成明顯降低。中和感染以后，ｉＮＯＳ逡逑合成較單純感染組則進(jìn)一步升高，而Ａｒｇ－Ｉ合成較單純感染組進(jìn)一步降低（圖３，逡逑＊ｐ＜０．０５）邋0逡逑Ａ邐ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｄ邐？逡逑ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ｉｎｆｅｃｔｅｄ邐＊邐＾邋0邐＿＊＿逡逑—＾一邋章■■■丨丨丨邐ｉＮ０Ｓ邐＾邐—＾ 邐ａ邋§邋°＇８＇邋ｒｎ邐＊逡逑＾邋０．４－邐ｋ邐邐逡逑一…邐＾邐ＪＬ．邋Ｈ邋＜邋０－６－逡逑邐邐Ｉ邐．邋■邋Ｗ邋，

本文編號：2589626