【摘要】：導(dǎo)致椎間盤退變的因素很多,而椎間盤的營養(yǎng)供應(yīng)減少是其中的因素之一。椎間盤是人體最大的無血管組織,營養(yǎng)供應(yīng)相對缺乏。椎間盤營養(yǎng)通過軟骨終板和纖維環(huán)這兩條途徑擴散入椎間盤內(nèi),而椎間盤內(nèi)髓核細胞的營養(yǎng)主要通過終板途徑獲得營養(yǎng)。隨著年齡逐漸增加,軟骨終板逐漸變薄、鈣化,軟骨終板的血管數(shù)量也就逐漸減少。髓核細胞營養(yǎng)供應(yīng)相對缺乏,從而導(dǎo)致髓核細胞數(shù)量減少,最終導(dǎo)致椎間盤退變。葡萄糖是椎間盤髓核細胞的營養(yǎng)成分之一,葡萄糖是通過糖酵解的方式向椎間盤提供能量的,故椎間盤需要消耗大量的葡萄糖。在椎間盤軟骨終板鈣化的情況下,軟骨終板限制了葡萄糖的通過,導(dǎo)致椎間盤髓核內(nèi)葡萄糖濃度降低,進而導(dǎo)致髓核細胞活性降低和凋亡增加。本實驗?zāi)康闹荚谘芯康蜐舛绕咸烟菍w外培養(yǎng)髓核細胞形態(tài)、生長及凋亡的影響,為椎間盤退變的病因?qū)W研究提供依據(jù)。 一、人椎間盤髓核細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定 人髓核組織取自脊柱側(cè)彎矯形手術(shù)患者,年齡在10-15歲,術(shù)前MRI檢查證實椎間盤信號與正常椎間盤信號一致。所取標本在超凈臺上仔細分離出韌帶、纖維環(huán)和軟骨終板,剪碎髓核組織。0.25%的胰蛋白酶消化約40min。0.2%Ⅰ型膠原酶和0.2%Ⅱ型膠原酶混勻消化約3h,待髓核組織變成絮狀物質(zhì)后,用DF12+ 10%FBS終止消化。離心,去除組織殘渣,加入DF12 +15%FBS培養(yǎng)液。細胞接種于培養(yǎng)瓶中,放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中觀察細胞形態(tài)學(xué)變化;MTT法繪制細胞生長曲線;甲苯胺藍染色觀察細胞形態(tài);GAG和Ⅱ型膠原免疫組化染色鑒定細胞表型。結(jié)果:GAG染色和Ⅱ型膠原染色對細胞進行鑒定所得細胞為髓核細胞,甲苯胺藍染色觀察細胞形態(tài)正常,MTT法繪制生長曲線顯示細胞生長良好。結(jié)論:胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶和Ⅱ型膠原酶混合培養(yǎng)法所得髓核細胞形態(tài)正常,細胞生長良好,表型表達為髓核細胞,滿足椎間盤體外實驗研究。 二、不同葡萄糖濃度的細胞培養(yǎng)液對體外培養(yǎng)椎間盤髓核細胞形態(tài)、生長和凋亡的作用 實驗中的髓核細胞為實驗一中培養(yǎng)的細胞。實驗分為四組:加入葡萄糖濃度為5mmol/L的培養(yǎng)液組(對照組);加入葡萄糖濃度為2.5mmol/L的培養(yǎng)液組;加入葡萄糖濃度為1mmol/L的培養(yǎng)液組;加入葡萄糖濃度為0mmol/L的培養(yǎng)液組。MTT法繪制生長曲線;培養(yǎng)48h和72h后,相差顯微鏡觀察髓核細胞形態(tài)變化;透射電鏡下觀察細胞超微結(jié)構(gòu)變化;流式細胞儀檢測細胞凋亡率。結(jié)果可以看到,隨著培養(yǎng)液中葡萄糖濃度的不斷降低,細胞數(shù)量也逐漸減少。這說明過低的葡萄糖濃度細胞培養(yǎng)液可抑制髓核細胞的增殖。對照組中,細胞呈多角形或短梭形。超微結(jié)構(gòu)顯示,細胞核為橢圓形,核膜完整,有1-3個大小不等的核仁。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張,線粒體結(jié)構(gòu)正常。在2.5mmol/L組、1mmol/L組、0mmol/L組中,倒置顯微鏡下均可見到大量的長梭形細胞,胞質(zhì)減少,折光性減弱等細胞衰老跡象。2.5mmol/L組、1mmol/L組中,透射電鏡可觀察到髓核細胞內(nèi)大量溶酶體和脂肪滴,濃縮的核染色質(zhì)邊聚。0mmol/L中,透射電鏡觀察細胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)變化為,胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)目明顯減少,細胞器破壞,胞膜不完整,部分細胞內(nèi)可見到空泡及吞噬現(xiàn)象。流式細胞儀檢測細胞凋亡率,隨著葡萄糖濃度的降低,細胞凋亡率逐漸增高。結(jié)論:隨著葡萄糖濃度的降低,人椎間盤髓核細胞的增殖被抑制,細胞凋亡率增加,細胞形態(tài)也發(fā)生改變。 營養(yǎng)供應(yīng)是椎間盤退變的重要因素之一,沒有充足的葡萄糖供應(yīng),椎間盤髓核細胞不能長時間存活。髓核細胞活性和功能的維持有賴于糖酵解過程產(chǎn)生的能量。糖濃度降低導(dǎo)致細胞能量供應(yīng)減少,細胞活性降低,凋亡增加等一系列細胞功能改變。
【圖文】：

原代未貼壁髓核細胞（×100）圖 2 部分貼壁的髓核細胞（×100）

Fig 3 Nucleus pulposus cells by toluidineblue staining（×100）Fig 4 Nucleus pulposus cells by toluidineblue staining（×200）3.2 髓核細胞表型鑒定細胞質(zhì)染色為磚紅色，細胞核深染。糖胺聚糖染色髓核細胞呈陽性，，說明細胞外基質(zhì)中含有糖胺聚糖(圖 5)。Ⅱ型膠原免疫組化染色細胞漿為棕
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R329

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 郭健行;黃桂成;;椎間盤退變影響因素研究進展[J];國際骨科學(xué)雜志;2008年01期

本文編號：2573797