【摘要】：腸道病毒71型(EV71)屬于微小核糖核酸病毒科(Picornavirdae),腸道病毒屬(Enterovirus, EV)。EV71的感染可以導(dǎo)致手足口病(HFMD),一般癥狀輕微,僅表現(xiàn)為皮疹或皰疹性咽峽炎,預(yù)后良好。重癥病例病情進(jìn)展迅速,可表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累和急性呼吸循環(huán)衰竭。人是EV71的唯一自然宿主,對(duì)EV71普遍易感,但以嬰幼兒和5歲以下兒童感染為主。 目前國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室診斷EV71感染的方法主要有病毒分離、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、中和試驗(yàn)、免疫組化檢測、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、核苷酸序列測定、基因芯片技術(shù)等,每種方法各有優(yōu)缺點(diǎn),而目前基層實(shí)驗(yàn)室尚缺乏快速和準(zhǔn)確的診斷方法。 本次研究以不同免疫方案制備EV71抗血清,篩選最佳免疫方案,同時(shí)利用制備的EV71高價(jià)抗血清建立間接ELISA試驗(yàn)方法,檢測本實(shí)驗(yàn)室采集的咽拭子標(biāo)本,對(duì)基層實(shí)驗(yàn)室開展EV71早期診斷具有重要意義。 目的 1.比較不同免疫方案制備EV71抗血清的免疫效果,選擇最優(yōu)免疫方案,為下一步制備EV71單克隆抗體(McAb)奠定免疫基礎(chǔ)。 2.用制備的EV71抗血清建立間接ELISA試驗(yàn)法,檢測HFMD患兒咽拭子標(biāo)本中的EV71,評(píng)價(jià)其檢出效果。 方法 1.用EV71的SDLY107株感染RD細(xì)胞并收獲病毒,初步純化后用50%終點(diǎn)法測定病毒滴度,取一部分病毒液以紫外線燈(40w)照射對(duì)病毒進(jìn)行滅活。 2.將BALB/c鼠隨機(jī)分為5組,每組9只。其中1-4組為實(shí)驗(yàn)組,第5組為對(duì)照組。1、2組以滅活病毒免疫,3、4組以活病毒免疫,1、3組的免疫間隔時(shí)間為2周,2、4組為3周；第5組用磷酸鹽緩沖液(PBS)免疫,免疫間隔2周,每組各免疫4次。 3.末次免疫后摘眼球取血,用間接ELISA試驗(yàn)法和中和試驗(yàn)(固定病毒-稀釋抗血清)法分別檢測各組小鼠血清抗體滴度。 4.用RD細(xì)胞分離2010年山東省臨沂市HFMD暴發(fā)期間采集的44份患兒咽拭子標(biāo)本中的病毒,RT-PCR法擴(kuò)增病毒分離液中的EV71并測序鑒定,作為EV71檢出的“金標(biāo)準(zhǔn)”。 5.以咽拭子標(biāo)本液作為包被抗原,制備的EV71抗血清作為一抗,辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG作為二抗,建立間接ELISA試驗(yàn)法檢測標(biāo)本中的EV71,與RT-PCR的檢測結(jié)果進(jìn)行比較。 結(jié)果 1.50%終點(diǎn)法測得EV71的病毒滴度為2×10-3.25/0.1ml,紫外線照射法完全滅活EV71的最短時(shí)間為30min。 2.ELISA結(jié)果顯示,4個(gè)實(shí)驗(yàn)組均產(chǎn)生陽性抗體(A/A02.1),對(duì)照組抗體陰性(A/A02.1),1-5組吸光度(A)值依次為1.0817±0.2897、1.0296±0.3719、1.0748±0.3749、1.4929±0.2159、0.1687±0.0218。對(duì)其進(jìn)行單因素方差分析,F=23.449,P0.05,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,LSD-t檢驗(yàn)結(jié)果,第4組與1、2、3組差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而其余組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 3.第4組(活病毒間隔3周免疫組)ELISA法測得抗體滴度為1.024×105,中和試驗(yàn)法測得抗血清中和效價(jià)為1：64。 4.咽拭子標(biāo)本接種RD細(xì)胞并盲傳二代后,100%出現(xiàn)細(xì)胞病變,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增并測序鑒定,均為EV71。 5.以EV71抗血清作為一抗,ELISA法檢測咽拭子標(biāo)本,陽性率為100%,與RT-PCR檢測結(jié)果相比,靈敏度、特異度、符合率均為100%。 結(jié)論 1.不同免疫方案制備的EV71抗血清,抗體滴度不完全相同,其中活病毒間隔3周免疫組抗體滴度最高,可作為制得高滴度EV71抗血清的理想選擇,并為制備EV71McAb奠定免疫基礎(chǔ)。 2.以EV71建立的間接ELISA法可早期、快速、準(zhǔn)確檢測患兒咽拭子標(biāo)本中的EV71,與RT-PCR擴(kuò)增病毒分離液的結(jié)果相比,靈敏度、特異度、符合率均為100%,可在基層實(shí)驗(yàn)室推廣使用。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R373

【參考文獻(xiàn)】

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1 朱托夫,張禮璧,葉千紅;用捕捉ELISA法檢測類脊髓灰質(zhì)炎患者血清中腸道病毒71型IgM抗體以進(jìn)行早期診斷[J];病毒學(xué)報(bào);1992年01期

2 楊國威,何雅清,薛穎,周世力,馬驪,金奇;腸道病毒71型外殼蛋白VP1在Pichia pastoris酵母中的表達(dá)[J];病毒學(xué)報(bào);2003年02期

3 周世力,楊帆,金奇;腸道病毒71型的研究進(jìn)展[J];病毒學(xué)報(bào);2003年03期

4 崔愛利,許文波,李秀珠,胡家瑜,凌華,唐偉,楊智宏,張燕,陳立,Hiroyuki Shimizu;腸道病毒71型的RT-PCR診斷及基因特征[J];病毒學(xué)報(bào);2004年02期

5 何雅青;楊洪;李琳琳;譚潔;毛麗莎;陽帆;劉建軍;呂星;周麗;;深圳地區(qū)2001~2004年腸道病毒71型部分VP1區(qū)基因分析[J];病毒學(xué)報(bào);2006年05期

6 朱俊萍;徐子剛;陳輝;張霞;范東瀛;王娟;;2007年北京地區(qū)兒童手足口病病原的初步篩查[J];病毒學(xué)報(bào);2009年01期

7 張壽斌;廖華;黃呈輝;譚慶瑜;張煒靈;黃艷;陳侃;邱素清;林靜;幸思忠;廖月紅;;深圳237例手足口病腸道病毒血清型基因及臨床特征[J];中國當(dāng)代兒科雜志;2008年01期

8 何雅青,楊洪,豐素娟,嚴(yán)志平;2000年深圳市腸道病毒71型的監(jiān)測[J];疾病控制雜志;2003年02期

9 裴耀文;李忠;張華寧;呂慧;孫娜;張巖;王爽;王宇路;王顯軍;;2009年山東省手足口病病例的病原學(xué)檢測分析[J];中華疾病控制雜志;2010年08期

10 高子芬;陸敏;;腸道病毒EV71感染重癥兒童的病理學(xué)特點(diǎn)[J];臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志;2008年05期

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本文編號(hào)：2572229