【摘要】：目的：研制玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）毒素抗獨(dú)特型單克隆抗體，以替代毒素標(biāo)準(zhǔn)品用于免疫學(xué)檢測(cè)，從而建立玉米赤霉烯酮無毒ELISA檢測(cè)技術(shù)。 方法：1.ZEN與O-(羧甲基)羥胺（CMO）反應(yīng)，衍生成半抗原ZEN-CMO，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS）鑒定半抗原，然后采用活潑酯法將ZEN-CMO分別與載體蛋白牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）偶聯(lián)制備人工抗原，紫外吸收光譜分析法、SDS-PAGE法鑒定人工抗原偶聯(lián)效果。通過動(dòng)物免疫及雜交瘤制備等技術(shù)制備ZEN單克隆抗體（Ab1），并對(duì)其效價(jià)、亞類、特異性等方面特性進(jìn)行鑒定； 2.在研制了ZEN單抗的基礎(chǔ)上，將ZEN單抗（Ab1）與載體蛋白KLH偶聯(lián)作為免疫原，Ab1經(jīng)固定化胃蛋白酶酶切，獲得ZEN單抗片段Fab，作為包被原，通過動(dòng)物免疫及雜交瘤制備等技術(shù)制備ZEN抗獨(dú)特型單克隆抗體（Ab2），并對(duì)其效價(jià)、特異性，類型等方面特性進(jìn)行鑒定； 3.研究ZEN抗獨(dú)特型抗體與ZEN毒素之間的相關(guān)性，并基于獨(dú)特型-抗獨(dú)特型反應(yīng)初步建立檢測(cè)玉米樣品中ZEN無毒ELISA檢測(cè)技術(shù)。 結(jié)果：1.制備了ZEN的人工抗原ZEN-BSA和ZEN-OVA，經(jīng)紫外吸收光譜分析法和SDS-PAGE法鑒定，人工抗原偶聯(lián)成功且偶聯(lián)比分別為3.1:1、16.9:1； 2.成功獲得1株穩(wěn)定分泌抗ZEN單抗的雜交瘤細(xì)胞株,命名為1G4，其細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)為1：6.4×10~3，，腹水效價(jià)為1：1.6×10~5，抗體亞類為Ig G2b，對(duì)ZEN的IC_(50)為10.2ng/ml，檢測(cè)限為0.58ng/ml； 3.成功制備出ZEN單抗的Fab片段, Western blot結(jié)果表明Fab分子量為50kD，間接ELISA結(jié)果表明Fab保持較高生物學(xué)活性； 4.成功獲得6株穩(wěn)定分泌ZEN抗獨(dú)特型抗體（Ab2）的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為1D5、2D9、3F8、3H8、6D8、2B7，細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)均達(dá)到1:120以上，腹水效價(jià)為1:1.2×10~5～1:2.0×10~5，間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)果表明這6株單抗（Ab2）與ZEN競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合ZEN單抗1G4（Ab1），均為β型抗獨(dú)特型抗體（Ab2β），這6株抗體對(duì)ZEN的IC_(50)值在10.09～54.48ng/mL之間； 5.利用ZEN單抗（Ab1）及ZEN抗獨(dú)特型抗體（Ab2β）建立了檢測(cè)ZEN無毒ELISA定量檢測(cè)技術(shù)，ZEN抗獨(dú)特型抗體與ZEN毒素之間的替代標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=57.21x-7.711，R~2=0.990（y為ZEN毒素濃度ng/mL；x為抗獨(dú)特型抗體濃度μg/mL），檢測(cè)限為2.63ng/mL，線性范圍為2.63～100.64ng/mL，實(shí)際玉米樣品的加標(biāo)回收率為82.13%～88.41%。批內(nèi)變異系數(shù)在8.25%～9.35%之間，批間變異系數(shù)在6.54%～9.41%之間。 結(jié)論：1.成功獲得了高效價(jià)，高特異性的ZEN單抗（Ab1）； 2.成功制備了ZEN抗獨(dú)特型單克隆抗體（Ab2），經(jīng)鑒定為β型抗獨(dú)特型抗體（Ab2β）； 3.ZEN抗獨(dú)特型單克隆抗體作為毒素的替代物與ZEN毒素標(biāo)準(zhǔn)品之間有較高的相關(guān)性，可以替代ZEN標(biāo)準(zhǔn)品用于免疫學(xué)檢測(cè)； 4.利用ZEN單抗及抗獨(dú)特型抗體初步建立了能用于檢測(cè)玉米樣品中ZEN無毒ELISA定量檢測(cè)技術(shù)。
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R392

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 田潔;三唑磷、氯霉素、玉米赤霉烯酮化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法研究[D];浙江大學(xué);2013年

本文編號(hào)：2569780