【摘要】：阿特拉津,又稱莠去津,是一種在全球范圍內(nèi)廣泛使用的三嗪類除草劑。其在土壤和水體中的殘留會影響人體健康并對全球生態(tài)環(huán)境造成危害。因此,對環(huán)境中阿特拉津的殘留量進行實時監(jiān)測和評估分析,有助于防范和應(yīng)對阿特拉津所來的負面影響。 目前對阿特拉津暴露風險監(jiān)測和評估的方法主要是基于大型儀器,而這些方法相對耗時,且成本較高。基于免疫學(xué)抗原-抗體反應(yīng)的快速檢測阿特拉津殘留方法則更高效、方便且經(jīng)濟。但免疫學(xué)方法檢測的關(guān)鍵是要獲得特異性強、親和力高的抗體。 噬菌體展示抗體庫技術(shù)(Phage Display Antibody Library technology)由于能繞過雜交瘤技術(shù)或動物免疫,而成為是迄今為止發(fā)展最成熟、應(yīng)用最廣泛的基因工程抗體制備技術(shù)之一。免疫抗體庫是指采用經(jīng)過免疫后的淋巴細胞構(gòu)建的抗體庫。由于用于構(gòu)建抗體庫的淋巴細胞已經(jīng)在體內(nèi)經(jīng)過抗原選擇和親和力成熟,因此從庫容較小(105-106)的免疫庫中就可以篩選到特異性強、親和力高的抗體。 本實驗利用阿特拉津免疫Balb/c小鼠脾臟為抗體庫基因來源構(gòu)建噬菌體scFv抗體庫,并用直接包被(固相)和磁珠(半固相)方法分別對scFv抗體庫進行了篩選。 主要研究內(nèi)容和結(jié)果分述如下： 1噬菌體展示免疫抗體庫的構(gòu)建 以提取的阿特拉津免疫小鼠脾臟總RNA為模板,經(jīng)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)mRNA成cDNA后,PCR擴增出重鏈可變區(qū)基因(VH)和輕鏈可變區(qū)基因(VL),SOE-PCR技術(shù)連接VH、VL和GS-linker成scFv。并將scFv與T7Select(?)10-3b載體連接,經(jīng)體外包裝成熟后感染宿主BLT5403擴增,得到了庫容量為1.0×105,滴度為2.0×1011的抗體庫。 2直接包被篩選阿特拉津特異抗體 利用硅烷法對酶標板表面進行氨基化修飾,并利用活性酯法將羥基化的阿特拉津偶聯(lián)在酶標板上。通過對抗體庫進行3輪的“孵育-洗脫-擴增”直接包被固相篩選。特異性噬菌體富集了185倍。從第三輪篩選的洗脫滴度平板中隨機挑取了16株噬菌體,經(jīng)PCR驗證共有9株噬菌體展示有scFv抗體。經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)有3株噬菌體所展示的scFv相同。另外隨機挑取了3株噬菌體,構(gòu)建pTIG-Trx-scFv表達載體。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達和純化后,對得到的scFv抗體進行了ELISA和間接競爭ELISA測定,最終得到一株針對阿特拉津的特異性抗體。 3磁珠法篩選阿特拉津特異抗體 利用活性酯法將羧基化的阿特拉津與氨基化的磁珠偶聯(lián),對抗體庫進行了4輪半固相篩選。特異性噬菌體富集了369倍。隨機從第四輪篩選的洗脫滴度平板中挑取47株噬菌體,通過噬菌體ELISA和間接競爭ELISA對噬菌體表面展示的抗體進行了親和力和特異性驗證,得到了一株對阿特拉津有特異性的噬菌體。PCR擴增抗體基因后構(gòu)建表達載體,對抗體進行了表達和純化,并對純化后的抗體的結(jié)合和競爭活性進行了鑒定。
【圖文】：

所抑制(smith，1985)。這是第一次對的噬菌體展示(ph技術(shù)的基本原理術(shù)是將外源將蛋白或膚段的基因克隆到噬菌體基因組面表達并展示。其主要特點是將特定分子的基因型與在噬菌體表面表達特定蛋白，，而在噬菌體核心中則含示在噬菌體表面的蛋白或多膚進行親和篩選，另外噬到擴增，該技術(shù)又將選擇能力和擴增能力聯(lián)系到一起，從數(shù)量眾多的多樣化噬菌體群體中選擇出能特異結(jié)合染大腸桿菌使選擇出的噬菌體得到擴增和富集，如圖冬生弓盛感~

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【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前6條

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本文編號：2564548