【摘要】：【目的】探討共培養(yǎng)環(huán)境中SD大鼠來源的髓核(nucleus pulposus, NP)細胞促使脂肪間充質(zhì)干細胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, ADSCs)向NP樣細胞定向分化的分子機制,為人類椎間盤退變性疾病的細胞移植治療奠定基礎。 【方法】(1)150g SD雌性大鼠斷頸處死,取腹股溝、腎周脂肪組織,0.1%膠原酶消化,體外接種培養(yǎng),采用極限稀釋法純化ADSCs;同時取大鼠椎間盤髓核組織,采用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)NP細胞。(2)利用流式細胞術對ADSCs進行鑒定。同時對NP細胞進行Ⅱ型膠原抗體染色鑒定。(3)分別取第三代ADSCs和原代NP細胞,消化計數(shù),調(diào)整細胞密度調(diào)至1×105/ml,ADSCs接種于六孔板中,NP細胞接種于BD培養(yǎng)池中;兩種細胞按1:1比率通過非細胞接觸共培養(yǎng)。(4)共培養(yǎng)2周后做TGF-β1受體免疫熒光檢測,提取ADSCs RNA做逆轉錄PCR和實時熒光定量PCR檢測。 【結果】(1)流式細胞檢測結果顯示脂肪間充質(zhì)干細胞Sca-1、CD44的陽性率分別為95.2%、99.7%,CD45、CD11b的陽性率分別為0.4%、1.5%。NP細胞Ⅱ型膠原抗體免疫染色陽性。(2)免疫熒光檢測結果顯示:共培養(yǎng)組熒光強度明顯高于單純ADSCs組。NP細胞分泌的細胞因子TGF-β1作用于ADSCs ,能促使ADSCs表面的TGF-β受體1的表達增加。(3)PCR檢測結果顯示:共培養(yǎng)環(huán)境中ADSCs在NP細胞的誘導下聚焦蛋白聚糖(aggrecan)、Ⅱ型膠原(CollagenⅡ)、sox-9等條帶均明顯亮于單純ADSCs組;共培養(yǎng)組Smad3和Smad4基因的表達量要高于單純ADSCs組。 【結論】實驗結果表明:共培養(yǎng)環(huán)境中NP細胞能促使ADSCs向NP樣細胞分化。
【圖文】：

Genes Primerssmad2 Forward 5'CGCTGGGTGCAGGGTAGA 3'Reverse 5'TTCCATCCCAGAAGTCTCTTCAC 3'smad3 Forward 5'CCATCCCCGAGAACACTAACTT 3'Reverse 5'TGGTGGTCGCTAGTTTCTCCAT 3'smad4 Forward 5'TCACCCCAGCAAGTGTGTCA 3'Reverse 5'TGTTTTAGTTCGTTCTTGTGTAGATCAG 3'GAPDH Forward 5'CGTGAAAAGATGACCCAGATCA 3'Reverse 5'CACAGCCTGGATGGCTACGT 3'表 2 Primers for Real-time PCR

C d圖 2. (a)倒置相差顯微鏡下 ADSCs 主要呈梭形和紡錘形，×100。 (b)ADSCs 免分子呈陽性,細胞核經(jīng) Hoechst 33258 染料復染，，×100。 (c) NP 細胞呈多角形，個卵圓形核，內(nèi)可見 1-3 個核仁，×100。（d）髓核細胞Ⅱ型膠原抗體免疫染色陽
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R329

【共引文獻】

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本文編號：2551877