【摘要】：目的探討轉(zhuǎn)染外源性基因GATA-4促進5-氮雜胞苷(5-azacytidine,5-aza)誘導的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向心肌細胞分化的作用。方法全骨髓法分離大鼠BMSCs,按照1∶2.5比率用脂質(zhì)體法將GATA-4(pVP22-GATA-4/myc-His)質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染第3代BMSCs,轉(zhuǎn)染72 h后加入10μmol/L 5-aza誘導24 h,觀察細胞形態(tài)變化。轉(zhuǎn)染48 h后,免疫細胞化學檢測GATA-4、myc的表達。于誘導后28 d免疫細胞化學及免疫印跡法檢測GATA-4、心肌肌鈣蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)的表達情況,以鑒定細胞分化。結(jié)果轉(zhuǎn)染72 h后,免疫細胞化學結(jié)果表明實驗組可見GATA-4、myc表達。誘導后28 d應用免疫細胞化學及免疫印跡法檢測結(jié)果顯示,實驗組GATA-4、cTnT表達顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論外源表達GATA-4能夠促進5-aza誘導的BMSCs向心肌分化。
【圖文】：

锨浚?24h后，少量BMSCs開始貼壁;72h后，大多數(shù)細胞已貼壁，貼壁細胞逐漸伸展呈多角形、紡錘形、圓形。原代培養(yǎng)中，細胞貼壁生長是以克隆集落的方式增殖。3～4d可見小的集落形成。7～14d，相鄰集落匯合成片達80%以上，呈旋渦狀或放射狀排列，此時可進行第1次傳代。傳代培養(yǎng)的細胞于2～4h開始貼壁，24h內(nèi)貼壁完全，形態(tài)與原代細胞相似，3～5d即可達到匯合，可以繼續(xù)傳代。第3代BMSCs形態(tài)基本單一，呈梭形的成纖維細胞狀，細胞排列成漩渦狀或放射狀(圖1)。圖1第3代大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(×200)Figure1ThethirdgenerationofBMSCs(×200)2．2外源性基因GATA-4轉(zhuǎn)染BMSCs及表達鑒定脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后，BMSCs可見漂浮的死亡細胞，48h達高峰，之后死亡細胞數(shù)減少，細胞恢復活力，開始增殖，，于轉(zhuǎn)染后72h，可匯合生長至80%～90%。應用免疫細胞化學法計算陽性細胞率，發(fā)現(xiàn)當質(zhì)粒DNA(μg)和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000(μL)的比率為1∶2．5時，轉(zhuǎn)染效率最高，故后續(xù)的轉(zhuǎn)染實驗均采用1∶2．5的體系比例。進行轉(zhuǎn)染后48h，取細胞爬片的BMSCs做免疫細胞化學染色顯示GATA-4(細胞核陽性表達)和myc蛋白(胞核胞質(zhì)陽性表達)的表達情況，結(jié)果顯示有部分棕黃色陽性表達細胞(圖2)，說明有GATA-4和myc蛋白的表達，即成功地將pVP22-GATA-4/myc-His質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染入BMSCs，轉(zhuǎn)染效率約為30%�？召|(zhì)粒組和對照組均無陽性結(jié)果。圖2BMSCs轉(zhuǎn)染后48hGATA-4、myc的陽性表達(免疫細胞化學染色×200)A．GATA-4胞核陽性;B．myc胞核胞質(zhì)陽性Figure2GATA-4，mycpositi
【作者單位】： 河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室 河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院
【基金】：河北省高等學�？茖W技術研究項目(QN2016159) 河北省大學生創(chuàng)新性實驗計劃項目(USIP2017034)
【分類號】：R541

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本文編號：2549592