發(fā)布時間：2019-09-19 15:01

【摘要】：目的:構(gòu)建土拉弗朗西絲菌Novicida亞種Cpf1蛋白編碼基因的原核表達質(zhì)粒,在大腸桿菌中表達、純化重組Fn Cpf1蛋白后,制備兔抗Fn Cpf1多克隆抗體。方法:利用PCR技術(shù)擴增Fn Cpf1基因,將其克隆到原核表達載體pET-32a(+)中并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達,通過鎳離子金屬螯合磁珠親和純化得到純度較高的Fn Cpf1蛋白,將純化蛋白免疫新西蘭大白兔制備Fn Cpf1多克隆抗體,并用間接ELISA法檢測兔抗血清效價、Western blot鑒定其特異性。結(jié)果:擴增得到3 900 bp的目的基因片段,克隆到表達載體pET-32a(+)后,通過雙酶切及測序證實pET-32a(+)-Fn Cpf1表達載體構(gòu)建成功,可誘導(dǎo)表達相對分子質(zhì)量160 k D的目的蛋白,經(jīng)SDS-PAGE分析其為可溶性,通過鎳離子金屬螯合磁珠親和純化得到純度為95%以上的Fn Cpf1蛋白,制備多克隆抗體并檢測兔抗Fn Cpf1抗血清ELISA效價達1:512 000,Western blot結(jié)果顯示制備的抗體可較好地與Fn Cpf1蛋白特異性結(jié)合。結(jié)論:在原核系統(tǒng)中成功表達了Fn Cpf1重組蛋白,并用純化后的蛋白制備出兔抗Fn Cpf1抗體,效價及特異性均良好,為進一步探討Cpf1蛋白的生物學(xué)特性打下實驗基礎(chǔ)。
【作者單位】： 重慶醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心病原生物學(xué)實驗室;重慶市中醫(yī)院檢驗科;
【基金】：重慶市科委基礎(chǔ)科學(xué)與前沿技術(shù)研究資助項目(編號:cstc2016jcyj A0277) 重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究資助項目(編號:KJ1500203) 重慶市衛(wèi)計委西醫(yī)資助項目(編號:2015MSXM081)
【分類號】：R392

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本文編號：2538195