【摘要】：手足口病(Hand foot and mouth disease, HFMD)是一種常見的傳播途徑復雜、傳染性較強、在短時間內可造成大規(guī)模流行的病毒感染性疾病,柯薩奇病毒A16型(Coxsackievirus A16, CA16)是其主要病原體之一,感染率常常超過感染總人數(shù)的60%,至今還沒有十分安全有效的疫苗和特效藥來預防和治療CA16感染。因此,研制出安全、有效的CA16疫苗對于手足口病的預防和控制至關重要。本課題從糞便中分離CA16,用現(xiàn)代化微載體技術制備CA16滅活疫苗,免疫小鼠,并對其免疫原性進行評價,為疫苗的研制提供了研究基礎。 本研究工作包括4個部分：(1)CA16的分離、鑒定；(2)CA16生物學特性研究；(3)微載體培養(yǎng)CA16并純化；(4)CA16全病毒滅活疫苗的免疫原性檢測。 (1)CA16的分離、鑒定 本研究選用Vero細胞從臨床標本中分離腸道病毒,并用RT-PCR初步鑒定是否含有CA16,將從編號為DC1的標本中分離到的野毒株經過三輪蝕斑篩選后形成大小均一的空斑,挑取單克隆,并放大培養(yǎng)至第7代(DC1P7),經RT-PCR、測序、電鏡觀察、免疫熒光等證明DC1P7為CA16,同時對本次分離的CA16VP1區(qū)進行系統(tǒng)進化分析,判定該CA16毒株屬于B2a亞型。 (2)CA16生物學特性研究 為了后期規(guī)�；囵B(yǎng)CA16并純化,首先對與此相關的CA16生物學特性進行研究,結果發(fā)現(xiàn)：①培養(yǎng)基中小牛血清濃度和pH對病毒的增殖有重要影響：選用GlBCO公司的DMEM培養(yǎng)基,無血清培養(yǎng)96h后CA16幾乎不病變或病變異常,血清濃度0.5%-2.5%時似乎隨著血清濃度的增加病變率增加；②培養(yǎng)基中NaHCO3濃度為0.165%左右時CA16增殖最快；③PEG沉淀和氯仿抽提對病毒滴度損失較大,且純化效果不佳,不能用于后期抗原的純化。④CA16在增殖過程中一部分釋放到培養(yǎng)液上清,但主要存在于細胞內；⑤CA16對高溫敏感,-20℃以下可長期保存。 (3)微載體規(guī)�；囵B(yǎng)CA16并純化 本實驗中使用濃度為3g/L微載體培養(yǎng)Vero細胞和制備大量CA16, Vero細胞在微載體上培養(yǎng)5～7天長成單層,接種適量CA16病毒液至微載體上單層Vero細胞,72h后CPE達80%以上,收毒,感染滴度約3.56×1010TCID50/ml,經蔗糖密度梯度離心純化后出現(xiàn)清晰灰白條帶,在電鏡下檢測發(fā)現(xiàn)45%-60%蔗糖區(qū)間帶和45%蔗糖帶中有較多CA16病毒顆粒,且較純。 (4)CA16全病毒滅活疫苗的免疫原性檢測 將經蔗糖密度梯度離心初步純化的CA16抗原吸出、透析除去蔗糖并濃縮,用β-丙內酯滅活后與A1(OH)3佐劑一起免疫動物,以免疫劑量8.6×104TCID50/只,分0,2,4周免疫三次,結果顯示：本實驗制備的CA16全病毒滅活疫苗具有較好的免疫原性,血清IgG抗體和中和抗體效價峰值分別達1:512、1:128,GMT分別為1：161.27、1：73.52。 本論文成功地應用Vero細胞分離出CA16,并對其相關生物學特性進行研究,采用微載體培養(yǎng)技術制備的CA16全病毒滅活疫苗具有較好的免疫原性,為疫苗的研制提供了研究基礎。
【學位授予單位】：昆明理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R392.1

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 李琳琳,何雅晴,朱俊萍,薛穎,朱雅芳,徐星曄,金奇;柯薩奇病毒A組16型中國分離株(Cox.A16 SHZH00-1)全基因組序列測定及分析[J];病毒學報;2005年03期

2 賈蕾;趙成松;張莉;李爽;張代濤;劉白薇;王全意;黎新宇;;腸道病毒71型和柯薩奇病毒A組16型感染的手足口病患兒的相關特征對比研究[J];中國當代兒科雜志;2011年08期

3 王娟;羅珍;范東瀛;高娜;朱俊萍;安靜;;2007-2008年北京地區(qū)CA16VP1區(qū)系統(tǒng)進化分析[J];第三軍醫(yī)大學學報;2009年23期

4 呂曉菊;;手足口病防治進展[J];華西醫(yī)學;2008年03期

5 廖英;謝鴻恩;;手足口病病原學檢測及臨床特點相關性研究[J];吉林醫(yī)學;2010年24期

6 張偉;王玉光;楊朝暉;龐保東;吳昊;楊巧芝;金敏;楊金玲;李興旺;劉清泉;張永利;;腸道病毒71型與柯薩奇A組16型混合感染致手足口病并發(fā)中樞神經系統(tǒng)感染臨床分析[J];中國全科醫(yī)學;2011年29期

7 沙愛龍;劉穎;;手足口病的研究概況[J];生命科學儀器;2007年11期

8 馬紹輝;陳俊英;李華;楊卉娟;施海晶;潘s，

本文編號：2536646