【摘要】：結(jié)核病(tuberculosis, TB)是由人型結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)感染引起的以肺部慢性肉芽腫炎癥病變?yōu)橹鞯穆詡魅静�。雖然卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin, BCG)的全球接種曾一度較好地控制了結(jié)核病,然而,由于多重/廣泛耐藥結(jié)核菌株的出現(xiàn)、結(jié)核一線藥物的失效、卡介苗在控制成人肺結(jié)核方面的逐步失效和艾滋病的合并感染,結(jié)核病已在全球死灰復燃。MTB目前已感染全球三分之一人口,2008年新增結(jié)核病例高達940萬,死亡病例170萬。在我國,目前近半數(shù)人口感染MTB,年新增病例150萬,死亡病例13萬。結(jié)核病已一躍成為我國傳染性疾病的首位,成為制約我國社會經(jīng)濟發(fā)展的重要因素。作為目前唯一獲準用于預防結(jié)核病的BCG,卻僅能預防兒童結(jié)核病和肺外結(jié)核,無法預防成人肺結(jié)核。如無有效的預防控制措施,在未來10年內(nèi)我國可能出現(xiàn)3000萬新增結(jié)核病患者,形勢嚴峻。因此,制備新型的可有效預防結(jié)核桿菌感染的疫苗及策略是控制結(jié)核病的當務(wù)之急。 目前,廣泛認為以分泌IFN-7的CD4+Thl細胞為特征的Th1型免疫應答在抗結(jié)核感染中發(fā)揮重要保護作用。為誘導多特異性Th1型細胞免疫,我所前期研究結(jié)核優(yōu)勢抗原Ag85A、Ag85B、ESAT-6和CFP10抗原,預測獲得四個T細胞表位多肽,將其插入結(jié)核桿菌熱休克蛋白HSP65的非關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域中,再構(gòu)建于真核質(zhì)粒pcDNA3.1,獲得以HSP65為基因載體的含四個表位的多表位基因疫苗pHSP65pep,該疫苗經(jīng)肌肉注射免疫可誘導特異性脾臟IFN-y+Thl細胞免疫和HSP65特異性血清IgG,具有一定的抗結(jié)核免疫保護作用(Vaccine2009;27:5313-19; Microbil Immunol.2009;53(10):541-9)。 然而,該疫苗還存在兩個不足之處,首先,我們觀察到免疫三個月后部分小鼠出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)腫脹的自身免疫病癥狀,與少數(shù)報道相符,其原因與結(jié)核HSP65蛋白與哺乳動物關(guān)節(jié)軟骨糖蛋白具有交叉抗原成分有關(guān)。因此有必要對基因疫苗的載體HSP65進行適當改造,使誘導自身免疫的危險降低。點突變與缺失改造的主要靶序列確定為HSP65蛋白的第180-188aa基序。 其次,該疫苗僅能誘導全身性(systemic immunity)免疫應答,而不能誘導黏膜免疫(mucosal immunity)。新近研究提示：結(jié)核特異性Thl細胞在肺黏膜的募集和激活才是疫苗保護的關(guān)鍵。滴鼻免疫是誘導肺黏膜免疫的最佳免疫方式,但黏膜微環(huán)境容易降解抗原,因此選擇優(yōu)良的黏膜遞送介質(zhì)是誘導肺黏膜免疫的關(guān)鍵。來源于幾丁質(zhì)(chitin)的天然生物多糖殼聚糖(chitosan)及其寡聚體一殼寡糖(chitosan oligosaccharides, COS)系陽離子多聚物,因其無毒、緩釋、促進黏膜吸附吸收等特性,成為黏膜遞送載體的良好候選。Chitosan和COS與DNA共聚可形成納米級均一復合物顆粒,不僅有助于黏膜緩釋,還利于黏膜M細胞的攝取從而增強抗原提呈。特別是COS,具有水溶性、低粘度和低分子量特性,更有助于制備多糖-DNA多聚復合物。 因此我們采用chitosan(殼聚糖)、COS(殼寡糖)與上述經(jīng)改造的多表位基因疫苗共聚形成結(jié)核黏膜基因疫苗,經(jīng)滴鼻免疫,以誘導的肺淋巴細胞中IFN-y+T細胞比例和肺灌洗液SIgA水平來評價其黏膜免疫效果；以脾淋巴細胞中IFN-γ+T細胞比例和血清IgG抗體效價評價其全身免疫效果；然后以大劑量BCG攻毒評價免疫保護效果。探討肺黏膜免疫的誘導在抗結(jié)核免疫保護中的意義。進一步,我們采用BCG初免-結(jié)核黏膜基因疫苗滴鼻加強免疫的策略,再次證實結(jié)核黏膜基因疫苗配合全民已接種的BCG免疫后的免疫保護效果。 獲得以下主要結(jié)果：一、結(jié)核多表位基因疫苗載體(HSP65)的改造及其免疫學特性研究 1)根據(jù)文獻提示：HSP65蛋白第180-188aa中含有自身免疫原性相關(guān)表位。于是對第二位的苯丙氨酸(Phe)、第五位的谷氨酰胺(Gln)和第八位的亮氨酸(Leu)分別予以點突變；同時對180-188aa整段缺失。針對pHSP65和pHSP65pep,分別得到4種突變質(zhì)粒,mutant-1(第二位Phe突變Ala)、mutant-2(第五位Gln突變Ala)、mutant-3(第八位Leu突變Ala)及mutant-4(整段缺失)。 2)將上述不同載體改造的質(zhì)粒,以未改造的pHSP65pep、pHSP65質(zhì)粒為對照,分別于0、2、4、6周肌肉注射免疫雌性BALB/c小鼠,每次50μg/只,每組10只小鼠,共4次。 3)檢測所改造質(zhì)粒的結(jié)核特異性免疫原性,發(fā)現(xiàn)：與未經(jīng)改造的pHSP65pep結(jié)核基因疫苗相比,mutant-3和4誘導的結(jié)核特異性IFN-γ+CD4+Th1細胞免疫應答均無顯著降低；而mutant-1和2誘導的T細胞應答低于未改造基因疫苗。提示：對載體HSP65蛋白第180-188aa的mutant-3和4的改造,不會影響HSP65載體的免疫原性及所含表位的免疫原性。 4)檢測各改造質(zhì)粒免疫小鼠可能誘導的自身免疫應答和病理,發(fā)現(xiàn)：免疫3個月后,未經(jīng)改造的pHSP65質(zhì)粒免疫的部分小鼠膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)輕度紅腫,血清抗dsDNA抗體有所升高,腎臟和關(guān)節(jié)病理HE染色及免疫復合物沉積試驗發(fā)現(xiàn)：原始pHSP65質(zhì)粒具有誘導輕微腎小球腎炎潛能；而各改造質(zhì)粒均未出現(xiàn)大體和病理異常,特別是mutant-4質(zhì)粒,與正常小鼠的腎臟、關(guān)節(jié)組織病理無異。提示：對于載體HSP65蛋白第180-188aa的點突變或缺失改造,使以該載體為基礎(chǔ)的結(jié)核基因疫苗誘導自身免疫應答的潛能降至最低,而其誘導結(jié)核特異性Thl免疫的能力不變,因此得到顯著改良。 5)綜合結(jié)核特異性免疫和自身免疫結(jié)果,選擇HSP65蛋白第180-188aa完全缺失突變質(zhì)粒作為后續(xù)實驗中多表位結(jié)核黏膜基因疫苗,為簡潔,仍使用pHSP65pep字樣代表。 6)利用PET-32a(+)系統(tǒng),體外表達并純化得到大量HSP65蛋白。經(jīng)WesternBlot鑒定為有活性的HSP65蛋白。 二、殼寡糖組裝結(jié)核黏膜基因疫苗的理化性質(zhì)及其免疫原性和抗結(jié)核免疫保護特性研究 為了誘導結(jié)核特異性黏膜免疫,采用兩種來源于幾丁質(zhì)的天然生物多糖,殼聚糖(chitosan)和殼寡糖(COS),分別與質(zhì)粒DNA通過共凝聚法制備了chi-DNA和COS-DNA復合物顆粒疫苗。研究了其理化特性以及在小鼠體內(nèi)的免疫原性和免疫保護特性。 1)以0.02%的chitosan溶液在酸性條件、0.4%的COS溶液在中性條件,分別與質(zhì)粒DNA復合形成chitosan-DNA(簡稱chi-DNA)和COS-DNA復合物顆粒。經(jīng)掃描電鏡和動態(tài)光散射證實為大小均一的球形顆粒,前者顆粒直徑約200-400nm,后者直徑約300-500nm。 2)以瓊脂糖凝膠電泳實驗檢測兩種多糖對DNA的保護效果,發(fā)現(xiàn)DNA與殼聚糖或殼寡糖形成緊密大分子復合物,無法在電場中泳動而留在加樣孔中。以高濃度DNase I消化裸露質(zhì)粒DNA很快被降解；而chi-DNA、COS-DNA中的DNA仍完好無損；如先以高濃度的chitosanase酶解多糖,使DNA被釋放,再加入DNase I, DNA可被降解。提示chitosan和COS均能保護DNA免受酶解。 3)體外,以pGL3-Control熒光質(zhì)粒為報告基因,以chi-DNA、COS-DNA、DNA分別轉(zhuǎn)染293T細胞,檢測熒光表達強度,發(fā)現(xiàn)：與裸露質(zhì)粒DNA相比,兩種黏膜介質(zhì)均可顯著促進報告基因的細胞表達,COS效果好于chitosan。 4)以chi-DNA、COS-DNA結(jié)核黏膜基因疫苗與裸露DNA疫苗分別于0、2、4、6周滴鼻免疫BALB/c小鼠,每次50μg,共4次,BCG皮下注射為對照。 5)與裸露基因疫苗相比,黏膜基因疫苗滴鼻免疫誘導了相當水平的全身性免疫,即高水平血清IgG和脾臟Thl免疫。在血清IgG方面,COS-DNA和chi-DNA均誘導了較高水平的血清IgG,效價分別為15000和12000,與裸露結(jié)核基因疫苗誘導的IgG效價類似(12000),但低于BCG(320000),其誘導的IgG類別均為IgG2a。在脾臟Thl細胞應答的誘導方面,COS-pHSP65pep與chi-pHSP65pep誘導的Thl細胞比例分別為2.88%和2.53%,顯著高于裸露質(zhì)粒DNA的1.22%和BCG組的0.85%。提示黏膜基因疫苗仍舊可誘導良好的全身性免疫應答。 6)黏膜免疫應答的誘導主要表現(xiàn)為肺灌洗液SIgA和肺內(nèi)Thl型免疫應答。在肺灌洗液SIgA方面,僅有天然多糖COS和chitosan組裝的結(jié)核基因疫苗誘導了高水平的SIgA,效價分別為1500和1000；裸露質(zhì)粒組誘導的SIgA效價低于200。而與chitosan相比,COS更為顯著地促進了HSP65特異性SIgA抗體親和力成熟。提示黏膜遞送系統(tǒng)組裝基因疫苗才能使其具有誘導特異性黏膜抗體的能力,且殼寡糖(COS)具有比殼聚糖(chitosan)更好的誘導SIgA能力。 7)在誘導肺黏膜特異性T細胞免疫應答方面,即肺黏膜IFN-y+Th1和CTL應答方面,首先,胞內(nèi)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)：COS-pHSP65pep誘導的肺臟Th1和CTL細胞比值為4.53%和7.25%,顯著高于裸露DNA組的1.75%(Th1)、2.68%(CTL)和BCG組的2.05%(Th1)、3.41%(CTL),略高于chi-pHSP65pep的3.87%(Th1)和5.13%(CTL)。其次,ELISPOT結(jié)果顯示：與DNA和BCG組相比,COS-DNA和chi-DNA顯著增加肺內(nèi)IFN-γ+Th1細胞數(shù)量,分別為220/120SFC/106細胞,相比COS-DNA效果更為顯著。提示滴鼻給予COS-DNA最為顯著地促進了全身及黏膜部位Thl型免疫應答的產(chǎn)生。 8)經(jīng)大劑量BCG攻毒后4周,檢測結(jié)核黏膜基因疫苗的免疫保護效果。發(fā)現(xiàn)：①不免疫小鼠攻毒后產(chǎn)生了嚴重的肺部炎癥灶和組織損傷,提示肺結(jié)核的產(chǎn)生。②各免疫組相比,裸露結(jié)核基因疫苗滴鼻免疫的保護效果有限,肺臟中可見明顯炎性病灶,肺泡結(jié)構(gòu)有擴張性改變；而經(jīng)COS和chitosan遞送的黏膜基因疫苗的免疫保護顯著增強,特別是COS-pHSP65pep組,僅發(fā)現(xiàn)極小炎癥灶和肺泡上皮組織增厚。③肺臟和脾臟菌落計數(shù)提示：對照組的脾、肺結(jié)核桿菌數(shù)達到105CFU；裸露結(jié)核基因疫苗免疫組小鼠的肺臟和脾臟中,仍有103數(shù)量級的結(jié)核桿菌；chitosan組裝結(jié)核基因疫苗組臟器細菌數(shù)降至101數(shù)量級；而經(jīng)COS組裝結(jié)核基因疫苗組臟器細菌數(shù)降至幾乎檢測不到。提示黏膜結(jié)核多表位基因疫苗滴鼻免疫可使肺、脾臟的結(jié)核桿菌數(shù)量降低4個數(shù)量級。免疫病理和菌落計數(shù)結(jié)果強烈提示：結(jié)核多表位基因疫苗pHSP65pep具有一定免疫保護效果；而以COS黏膜遞送系統(tǒng)進行黏膜遞送后,因顯著增強了肺黏膜免疫T細胞和抗體應答,從而顯著增強了抗結(jié)核免疫保護效果。 三、BCG初免-殼寡糖組裝結(jié)核黏膜基因疫苗加強免疫策略的抗結(jié)核保護研究 基于我國普遍計劃接種BCG的事實,在應用方面,研究BCG初免(prime)-黏膜基因疫苗加強(boost)免疫策略將更具有現(xiàn)實意義。 1) BALB/c小鼠0周時行皮下初次免疫1×104CFU BCG,再以chi-DNA、 COS-DNA復合物顆粒和裸露DNA疫苗分別于2、4、6周滴鼻加強免疫3次,每次質(zhì)粒50μg,1×104CFU BCG皮下注射4次組作為陽性對照。 2)在血清IgG水平方面：與前次免疫相比,BCG初免-結(jié)核黏膜基因疫苗加強策略顯著增強了HSP65特異性血清IgG水平,效價均有顯著提高,COS-DNA組和chitosan-DNA組分別誘導了效價達120000的IgG,高于裸露質(zhì)粒DNA加強免疫誘導的IgG(50000)。IgG亞類仍以IgG2a為主。 3)在全身T細胞應答方面：COS-pHSP65pep組脾臟CD4+IFN-γ+T和CD8+IFN-γ+T細胞比例相對各組最高,為2.15%和1.57%,顯著高于其他各組(p0.05)。提示該策略在脾臟中誘導Thl型細胞應答為主,CTL應答不明顯。 4)在肺灌洗液SIgA誘導方面：COS-DNA疫苗加強免疫誘導的SIgA效價為1300,顯著高于chitosan-DNA疫苗誘導的700；而裸露DNA疫苗加強免疫未能誘導肺灌洗液SIgA,提示COS在增強黏膜抗體應答方面的優(yōu)勢。 5)肺黏膜T細胞應答方面：COS-pHSP65pep組誘導了9.32%的CD4+IFN-γ+Th1,顯著高于裸露基因疫苗和BCG組的6.43%和5.68%(p0.001),同時,其誘導的肺內(nèi)CTL細胞比例為9.65%,與chitosan-DNA組結(jié)果類似,而顯著高于pHSP65組的6.78%(p0.05),提示BCG初免后COS仍然能夠顯著增加pHSP65基因疫苗誘導原本難以誘導的肺淋巴細胞Th1和CTL比例。 6)經(jīng)BCG攻毒后,發(fā)現(xiàn)：經(jīng)COS和chitosan遞送的黏膜基因疫苗的免疫保護顯著增強,特別是COS-pHSP65pep組,僅發(fā)現(xiàn)極小炎癥灶和肺泡上皮組織增厚。菌落計數(shù)提示：對照組的脾、肺結(jié)核桿菌數(shù)達到105CFU:chitosan組裝結(jié)核基因疫苗組臟器細菌數(shù)降至101數(shù)量級；而COS組裝結(jié)核基因疫苗免疫組臟器細菌數(shù)降至100。提示BCG初免-chitosan/COS黏膜結(jié)核基因疫苗加強策略,顯著增強了結(jié)核基因疫苗的免疫保護功能。 本研究在免疫所前期自主構(gòu)建的結(jié)核多表位基因疫苗pHSP65pep勺基礎(chǔ)上,在兩方面進行了優(yōu)化。首先,對其具有一定自身免疫原性的載體HSP65載體蛋白進行了缺失突變改造,保留其誘導結(jié)核特異性免疫應答能力,但降低了其誘導自身免疫的可能。其次,為更好地誘導肺內(nèi)黏膜免疫,以早期清除肺內(nèi)結(jié)核分枝桿菌,采用兩種黏膜遞送載體介質(zhì)：殼聚糖(chitosan)、殼寡糖(COS)與改造后的結(jié)核黏膜基因疫苗,組裝成為具有納米顆粒特性的結(jié)核黏膜基因疫苗chitosan-pHSP65pep和COS-pHSP65pep。經(jīng)滴鼻免疫,證實上述兩種結(jié)核黏膜基因疫苗在保留誘導全身性免疫應答(血清IgG、脾臟T細胞應答)的基礎(chǔ)上,均可顯著增強特異性肺黏膜免疫應答,包括裸露基因疫苗難以誘導的肺灌洗液SIgA,和良好水平的肺淋巴細胞IFN-γ+Th1應答。其中,殼寡糖具有比殼聚糖更為顯著的增強黏膜免疫應答的能力。經(jīng)攻毒評估保護效果發(fā)現(xiàn)：兩種結(jié)核黏膜基因疫苗均可增強抗結(jié)核保護,特別是COS-DNA黏膜基因疫苗,發(fā)揮了最好的免疫保護能力。最后采用BCG初免-黏膜基因疫苗加強策略,進一步證實了結(jié)核黏膜基因疫苗增強黏膜免疫和增強抗結(jié)核免疫保護效果的作用。 我們的研究,以誘導肺黏膜免疫為疫苗研制出發(fā)點,創(chuàng)新性地采用兩種幾丁質(zhì)來源的天然陽離子生物多糖,與基因疫苗復合形成結(jié)核黏膜基因疫苗,證實殼寡糖(COS)組裝的結(jié)核黏膜基因疫苗具有優(yōu)良的增強肺內(nèi)黏膜免疫應答的能力；同時提示：肺內(nèi)黏膜免疫的誘導是抗結(jié)核免疫保護的關(guān)鍵,具有重要的意義。本研究為新型結(jié)核疫苗的分子設(shè)計和結(jié)核病防治提供了新的思路和技術(shù)平臺。
【圖文】：

達250SFC/106脾臟淋巴細胞，幾乎無差別；而MT1和MT2誘導的特異性T細胞應答有所降低（圖1.5)。MB 4 peptidescn HSP65Cud BCG450"! NS1 |-J^ rtj"If"- ill MO a J, T ::: i J!”。? n wh^ so- T , 1 y in ^z z zJ> S謾<J ^ ^ ^ J?f/ ^ / / 安旁旁矛旁圖1.5突變基閃疫苗pHSP65pep-MTl/2/3/4和pHSP65-MTl/2/3/4肌注免疫后經(jīng)4-肽、HSP65蛋白、BCG刺激后小鼠脾臟IFN-y'T細胞的ELISPOT結(jié)果NS:not significantFig. 1.5 Counts of splenic IFN-y'T cell in mice which intramuscularly vaccinated withpHSP65pep-MTl/2/3/4 and pHSP65-MT 1/2/3/431

保留了原始基因疫苗的T細胞應答免疫原性，，而MT1和MT2誘導T細胞應答能力有所降低，不適于后續(xù)使用（圖1.6)。A B1.76 1.83 1.25 1 10 2,73 3.03 ,?】? 11*. i|'- 1,，. ig'? id'- IJ' I a' 'O^-J . M. ., J J ,- - .m J ,徒 IJ . 3.. .1 J ., .1,?， li i?< 1#" ifJ 1?， ig' ,0> ，》? '?‘ l#* 、！f 1?， 10* t(t* 'S"pHSP65|>ep-MTl r"SP65pep-MT2 pHSP65|>ep-MT3 pHSP65pep^MTI pHSP65pepMT2 p1ISP65pei> MT3211 1.SS 1.30 4.81 J J 5.05 ^ 1.48 ^ 1.?) ,?? '?‘ "‘ I ，’，u ,., y ,, u ,.. L_ ?? u , u’
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【參考文獻】

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1 ;Antitumor and antiangiogenic activities of anti-vascular endothelial growth factor hairpin ribozyme in human hepatocellular carcinoma cell cultures and xenografts[J];World Journal of Gastroenterology;2007年47期

本文編號：2535228