【摘要】：目的體外培養(yǎng)正常BRL大鼠肝細胞，進行蛋氨酸負載（methionine loading）后，測定Hcy相關(guān)代謝物及代謝酶的變化，探討蛋氨酸負載對大鼠肝細胞Hcy相關(guān)代謝途徑的影響并探討其相關(guān)機制，以建立高同型半胱氨酸細胞模型，為進一步研究高同型半胱氨酸血癥的營養(yǎng)干預(yù)及其機制奠定基礎(chǔ)。 方法 1.采用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)BRL大鼠肝細胞。 2.采用MTT法檢測不同濃度Met負載對肝細胞存活率的影響。 3.采用HPLC法檢測肝細胞內(nèi)和培養(yǎng)液中Hcy及相關(guān)代謝物的含量。 4.采用氨基酸自動分析儀檢測培養(yǎng)液中與Hcy代謝相關(guān)的氨基酸含量及細胞內(nèi)BHMT活性。 5.采用HPLC法測定細胞內(nèi)SAM、SAH含量及SAHH活性。 6.采用分光光度法測定細胞內(nèi)CBS和MS活性。 結(jié)果 1.分別以10、20、50、100、200mmol/L Met作用于BRL大鼠肝細胞1、2、3、4h后，檢測肝細胞存活率的變化。當(dāng)Met濃度≤100mmol/L時，各時間點內(nèi)肝細胞的存活率均在91.8%以上。 2.20、50、100mmol/L Met分別作用于肝細胞后，20、50mmol/L Met組Hcy的生成量在1~4h內(nèi)基本持平，而100mmol/L Met組隨時間延長Hcy的生成量有增加的趨勢。因此，選擇20、50mmol/L Met作用于肝細胞1h為Met負載模型的條件。 3.與空白對照組相比，20mmol/L Met組培養(yǎng)液中Hcy、Cys、Ser、胱氨酸的含量顯著增加（P0.05），Glu、Gly、Tau的含量顯著減少（P0.05）；50mmol/LMet組培養(yǎng)液中Hcy、Cys、胱氨酸的含量顯著增加（P0.05），，Glu、Gly的含量顯著減少（P0.05）。與20mmol/L Met組相比，50mmol/L Met組培養(yǎng)液中Hcy、Cys、GSH、Gly和Tau的含量顯著增加（P0.05），Ser的含量顯著減少（P0.05）。 4.與空白對照組相比，20和50mmol/L Met組SAM含量、SAM/SAH比值、SAHH的水解與合成活性均顯著增加（P0.05）；BHMT活性顯著降低（P0.05）；20mmol/L Met組的MS活性顯著降低（P0.05）；50mmol/L Met組的SAH含量顯著減少（P0.05）。與20mmol/L Met組相比，50mmol/L Met組SAM和SAH的含量顯著減少（P0.05），SAM/SAH比值顯著增加（P0.05）。 結(jié)論 1.成功建立了Met負載大鼠肝細胞模型。 2.對培養(yǎng)液中Hcy及其代謝相關(guān)的一些氨基酸的含量進行分析。結(jié)果表明，Met負載顯著增加Hcy、Cys含量，影響Glu、Gly、Ser的含量，提示高Met負載后Hcy及其代謝相關(guān)的一些氨基酸的含量均發(fā)生變化。 3.進一步對肝細胞勻漿中Hcy代謝相關(guān)物質(zhì)SAM、SAH的含量和Hcy代謝相關(guān)酶SAHH、MS、BHMT、CBS活性進行分析。結(jié)果顯示，Met可顯著增加細胞內(nèi)SAM含量，增加SAM/SAH比值，提示在Met作用下，細胞的轉(zhuǎn)甲基化作用增強；在20mmol/L和50mmol/L Met組SAHH活性均顯著性增強、BHMT活性均顯著性降低，在20mmol/L Met組MS活性顯著降低。酶活性測定結(jié)果提示在Met負載下，肝細胞的Hcy再甲基化途徑受到抑制，且在20mmol/L Met組Hcy再甲基化途徑被抑制程度更為顯著。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R329

【參考文獻】

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本文編號：2535040