【摘要】：背景： 晚期糖基化產(chǎn)物(Advanced glycation end products, AGEs)是非酶糖化反應(yīng)的終末期產(chǎn)物,正常人隨著年齡的增加,AGEs會(huì)緩慢增加,但糖尿病病人由于長(zhǎng)期高血糖狀態(tài),導(dǎo)致體內(nèi)糖化反應(yīng)及AGEs生成加速。已有多項(xiàng)研究表明AGEs是引起糖尿病血管并發(fā)癥的重要誘因之一。AGEs能夠在糖尿病病人血管壁沉積,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)增殖,從而加速動(dòng)脈粥樣硬化的形成。自噬是一種溶酶體依賴的細(xì)胞內(nèi)受損細(xì)胞器或代謝產(chǎn)物的降解過程,其作為細(xì)胞的防御保護(hù)機(jī)制,與細(xì)胞凋亡之間有密不可分的聯(lián)系。但關(guān)于AGEs與自噬之間可能存在的病理生理關(guān)系,目前尚不清楚。本文研究以研究自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)作為衡量自噬水平的主要指標(biāo),初步研究了AGEs誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞自噬的相關(guān)機(jī)制及其在AGEs誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞增殖中的作用。為臨床上防治糖尿病合并動(dòng)脈粥樣硬化開辟新的途徑。 目的： 明確自噬機(jī)制在AGEs誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖過程中的作用。探討AGEs誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞自噬的相關(guān)信號(hào)通路機(jī)制以及晚期糖基化產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products, RAGE)在其中的作用。 方法： Western Blotting檢測(cè)AGEs處理大鼠血管平滑肌細(xì)胞A7R5后自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ, MAPK通路相關(guān)蛋白,Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白,RAGE的表達(dá),免疫熒光檢測(cè)AGEs處理A7R5細(xì)胞后自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá),電鏡技術(shù)檢測(cè)AGEs處理A7R5細(xì)胞后自噬體的表達(dá)。四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)平滑肌細(xì)胞的增殖,RAGE小干擾RNA (siRNA)轉(zhuǎn)染前后A7R5細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)變化。 使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示,數(shù)據(jù)錄入SPSS17.0完成統(tǒng)計(jì)分析,兩組之間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn),組間比較采用one-way ANOVA。以P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P0.01為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果： AGEs處理VSMCs后,自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)顯著上調(diào)并呈時(shí)間濃度依賴性,電鏡觀察到細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量增加,免疫熒光觀察到胞漿內(nèi)出現(xiàn)LC3顆粒；與對(duì)照組比較,AGEs處理組平滑肌細(xì)胞增殖能力增加,自噬抑制劑3-MA預(yù)處理的AGEs組細(xì)胞增殖能力被抑制。AGEs能夠激活ERK,JNK, P38的磷酸化水平,同時(shí)抑制Akt, mTOR的磷酸化水平。分別使用ERK抑制劑PD98059, JNK抑制劑SB203580, P38抑制劑SP600125, Akt激活劑IGF-1預(yù)處理后,只有PD98059預(yù)處理組和IGF-1預(yù)處理組能夠抑制AGEs誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞自噬。用RAGE-siRNA干擾A7R5細(xì)胞RAGE的表達(dá)后,AGEs誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)增高現(xiàn)象被抑制。 結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)以大鼠血管平滑肌細(xì)胞系A(chǔ)7R5為對(duì)象,研究AGEs對(duì)血管平滑肌細(xì)胞自噬水平產(chǎn)生的影響。AGEs通過ERK和Akt依賴的信號(hào)通路誘導(dǎo)的自噬參與了AGEs誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖。對(duì)AGEs-RAGE-自噬通路進(jìn)行調(diào)節(jié)可能是預(yù)防糖尿病病人動(dòng)脈粥樣硬化的潛在治療靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R363.2

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本文編號(hào)：2527434