【摘要】：γδT細胞是脊椎動物體內(nèi)T淋巴細胞的一個重要亞群,它在抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等方面均具有重要作用。Vγ9Vδ2 T細胞是人外周血中γδT細胞的主要亞群,可以通過T細胞受體(TCR)識別病原微生物的非肽類抗原和類似于自然殺傷的兩種方式發(fā)揮抗腫瘤作用。本實驗旨在構(gòu)建Vγ9Vδ2 T細胞受體的融合片段,并通過在原核系統(tǒng)中大量表達Vγ9Vδ2蛋白為進一步研究γδTCR的晶體結(jié)構(gòu)和生物學功能提供有力工具。 目的: 將Vγ9和Vδ2片段融合,探討Vγ9Vδ2融合片段在不同載體中的表達情況,找到適合Vγ9Vδ2大量可溶表達的條件,從而為闡明Vγ9Vδ2 T細胞受體與抗原相互作用的結(jié)構(gòu)基礎提供條件,為探索γδT細胞新的配體提供有效工具,為臨床更好地應用γδT細胞抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫功能提供理論基礎和研究方向。 方法: 1.Vγ9Vδ2 T細胞受體基因全長的獲取。從志愿者肘靜脈抽取外周血,加入抗凝劑和PBS,與Ficoll分離液一起,通過梯度離心法分離單個核細胞。提取總RNA后,利用RT-PCR法分別擴增Vγ9Vδ2 T細胞受體的γ鏈和δ鏈基因全長。 2.Vγ9和Vδ2融合片段的構(gòu)建。用含有連接子序列的特異性引物分別擴增Vγ9和Vδ2片段,通過overlap PCR將兩者融合。 3.篩選適合Vγ9Vδ2融合片段表達的原核載體。將Vγ9Vδ2融合片段分別連接到pGEX-6p-1、pET28a、pET32a和pET43.1a,小量表達后檢測Vγ9Vδ2的各個表達情況。 4.Vγ9Vδ2-pET43.1a的大量表達和純化。將小量表達情況較好的含有Vγ9Vδ2-pET43.1a質(zhì)粒的大腸桿菌大量培養(yǎng),裂解后通過Ni-NTA純化Vγ9Vδ2的融合蛋白。 結(jié)果: 1.正確的Vγ9Vδ2 T細胞受體γ鏈和δ鏈序列全長。γδT細胞在人類外周血中占有的比例非常少,僅占總T淋巴細胞的5%左右。由于豐度較小,研究者大多先用誘導物刺激外周T淋巴細胞通過γδT細胞的擴增得到細胞株,然后提取RNA通過反轉(zhuǎn)錄PCR得到目的基因。而我們通過從外周血分離單個核細胞后直接提取RNA,經(jīng)RT-PCR和膠回收后將目的片段連接到測序載體pEASY-T3上,經(jīng)測序驗證,正是Vγ9Vδ2 T細胞受體序列全長。 2.Vγ9和Vδ2片段融合。γδT細胞受體是γ和δ兩條鏈組成的異源二聚體。雖然兩條鏈由V區(qū)、(D區(qū),δ鏈)、J區(qū)和C區(qū)組成,但它們識別抗原和與抗原結(jié)合的部位均在V區(qū)。本實驗中我們首先通過特異性引物擴增Vγ9Vδ2 T細胞受體的γ鏈V區(qū)片段Vγ9和δ鏈V區(qū)片段Vδ2,然后用連接子(Gly4Ser)4連接起來,使兩者融合表達,這樣既便于表達,又利于研究Vγ9Vδ2 T細胞受體的真實結(jié)構(gòu)和功能。 3.表達載體的優(yōu)化。作為一種膜蛋白,Vγ9Vδ2 T細胞受體的表達情況一直是限制研究其結(jié)構(gòu)和功能的一個瓶頸。它在很多載體和菌株中均不表達,或者以包涵體的形式表達。而研究其功能最需要的是要使之在上清中表達。我們依據(jù)實驗經(jīng)驗和文獻,對比不同的載體發(fā)現(xiàn),與經(jīng)典的pGEX-6p-1、pET28a和pET32a相比,Vγ9Vδ2在pET43.1a載體上表達量較多,而且定位在上清中。 4.Vγ9Vδ2-pET43.1a的大量表達和純化。將構(gòu)建好的重組載體Vγ9Vδ2-pET43.1a轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞BL21(DE3),大量培養(yǎng)后裂解菌體,離心取上清過Ni-NTA純化目的蛋白。此時的目的蛋白與載體pET43.1a上的標簽NusA融合在一起。SDS-PAGE和western證實已獲得純度較高的Vγ9Vδ2-NusA融合蛋白。 5.Vγ9Vδ2-pET43.1a蛋白的酶切鑒定。將Vγ9Vδ2-NusA融合蛋白通過precission protease酶切分開,并通過Vδ2特異抗體驗證酶切結(jié)果。 結(jié)論: 從人外周血中分離單個核細胞后直接提取RNA,反轉(zhuǎn)錄后通過PCR即可獲得Vγ9Vδ2 T細胞受體兩條鏈基因的全長序列。用連接子連接的Vγ9Vδ2重組片段在表達載體pET43.1a上有較好的表達,并能夠與載體上的標簽NusA很好地分離。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392

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本文編號：2526793