【摘要】：乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)屬嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)正嗜肝DNA病毒屬,HBV感染嚴(yán)重威脅人類生命健康,可引起急、慢性肝炎、肝衰竭、肝硬化、肝癌以致死亡。全球約有30億人曾經(jīng)感染過HBV,將近3.5億人為慢性HBV感染者。我國1992年和2006年全國HBV感染血清流行病學(xué)結(jié)果顯示,隨著乙肝疫苗預(yù)防接種納入新生兒計劃免疫后,一般人群的HBsAg陽性率已經(jīng)明顯下降,從92年的9.75%下降到06年的7.18%,使我國由原來的高流行區(qū)降為中度流行區(qū),但仍可推算出約9300萬乙肝攜帶者,其中慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者約有2000萬例。在《中國病毒性肝炎的流行現(xiàn)狀及其相關(guān)問題分析報告》中估算出我國每年因慢性乙肝(包括肝硬化、肝癌)的直接和間接醫(yī)療費用約6000億元,給患者和國家造成了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。 乙型肝炎治療任重而道遠(yuǎn),在針對乙型肝炎的治療藥物中,諸如干擾素、胸腺肽α1、核苷類似物、多肽類藥物、治療性疫苗及中草藥等,到目前為止,尚未發(fā)現(xiàn)能夠根除乙肝病毒的藥物。目前應(yīng)用于臨床的高效價免疫球蛋白(HBIG)采用健康人即抗-HBsAg陽性的人血制備的,可以中和并清除侵入人體的乙肝病毒,使機(jī)體免受乙肝病毒的感染。由于血源來源有限、制備成本高且存在病原體潛在感染的危險,限制了其在臨床上的應(yīng)用�？贵w庫技術(shù)能夠篩選出高親和力的特異性單克隆抗體,從而使大規(guī)模生產(chǎn)人源化乙肝抗體成為可能�；诖�,本研究中篩選人源抗HBsAg抗體包括以下三部分內(nèi)容： 一、人源抗乙型肝炎病毒表面抗原Fab噬菌體抗體庫的構(gòu)建和篩選 選取5名乙肝表面抗體(HBsAb+)陽性的健康志愿者,接種國產(chǎn)乙肝疫苗進(jìn)行加強(qiáng)免疫,兩周后采集志愿者外周血并分離出淋巴細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA,使用Oligo dT引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,利用特異性的8對Lambda輕鏈子庫引物、5對Kappa輕鏈子庫引物和8對重鏈引物擴(kuò)增出輕重鏈Fd片段,輕鏈和重鏈分別通過SacⅠ/XbaⅠ和Xhol/SpeⅠ酶切位點克隆到pComb3H載體中,成功電轉(zhuǎn)構(gòu)建4個Kappa子庫和Lambda子庫,細(xì)菌抗體庫鑒定結(jié)果表明所構(gòu)建Fab噬菌體抗體庫庫容量達(dá)到3×108以上,抗體基因插入率接近100%,符合篩庫的標(biāo)準(zhǔn)。 在成功構(gòu)建了噬菌體抗體庫的基礎(chǔ)上,采用輔助噬菌體VCSM13包裝成Fab噬菌體抗體庫,利用商品化的乙肝表面抗原蛋白對抗體庫進(jìn)行富集篩選。并通過序列測定確定所獲各株抗體的基因序列,與v-base database中抗體序列信息進(jìn)行比較,確定其CDR區(qū)。序列測定結(jié)果顯示共有20株輕重鏈系列均不相同的克隆株,通過ELISA實驗證明這些抗體均為特異性HBsAg抗體,通過競爭性ELISA發(fā)現(xiàn)20株抗體可以競爭結(jié)合3個不同表位。 二、人源抗乙型肝炎病毒表面抗原全抗體表達(dá)及功能鑒定 在利用原核細(xì)胞XL1-Blue表達(dá)Fab抗體的基礎(chǔ)上,分別利用哺乳動物瞬時表達(dá)系統(tǒng)和桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞技術(shù)平臺實現(xiàn)了全抗體的真核分泌表達(dá)。將篩選出的20株抗體中具有高滴度6株Fab抗體的輕鏈和重鏈Fd段基因插入桿狀病毒載體pAc-L-FcR中,然后將構(gòu)建完成的重組質(zhì)粒與桿狀病毒重組后轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞,同時將其輕重鏈可變區(qū)基因插入HL51-14哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體后,轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。通過直接免疫熒光檢測真核表達(dá)效果,收集昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞表達(dá)上清進(jìn)行親和層析純化。利用SDS-PAGE檢測純化后抗體的純度、ELISA方法檢測純化后的抗HBsAgIgG全抗體的功能活性,結(jié)果表明純化后的人源HBsAg單克隆抗體抗體純度達(dá)到98%以上,并且具有良好的生物活性。 三、人源抗乙型肝炎病毒表面抗原IgG全抗體親和力研究 將純化后的抗HBsAg IgG全抗體分別利用非競爭性ELISA方法和BIAcoreSPR檢測方法檢測其親和力,結(jié)果顯示含有同一重鏈基因的各株抗體的親和力較高,KD值達(dá)到10-9mol/L(abbr.M),而兩種表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的同一株抗體的親和力活性無明顯差異。 綜上所述,本研究通過基因工程抗體制備技術(shù)平臺,運用噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù),從乙肝疫苗加強(qiáng)免疫后的HBsAb+志愿者的外周血中獲得Fab段抗體基因,成功構(gòu)建了人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗體文庫,容量為2×107克隆/ml,輕、重鏈基因插入率均接近100%。用商品化的乙肝病毒表面抗原對Fab噬菌體抗體庫進(jìn)行富集篩選,經(jīng)過特異性ELISA、序列測定證實共獲得了20株特異性針對乙肝病毒表面抗原的人源Fab單抗,滴度測定后選取6株滴度較高的抗體進(jìn)行全抗體表達(dá)。將重鏈基因不同的3株Fab抗體的輕鏈和重鏈Fd段基因,分別克隆入昆蟲細(xì)胞全抗體表達(dá)載體pAC-L-FcR,轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞,利用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)實現(xiàn)全抗體的分泌型表達(dá)；將重鏈相同的的4株Fab抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)基因,分別克隆入哺乳動物全抗體表達(dá)載體HL51-14,轉(zhuǎn)染,293T細(xì)胞,利用雙質(zhì)粒/哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)實現(xiàn)全抗體的分泌型表達(dá)。通過直接免疫熒光檢測表達(dá)效果,收集上清進(jìn)行純化,共獲得6株7種純度較高的IgG全抗體。利用ELISA對獲得的全抗體進(jìn)行功能鑒定,結(jié)果表明7種人源IgG全抗體為特異性的抗乙肝表面抗原抗體,兩種表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的抗體滴度顯示293T細(xì)胞表達(dá)的抗體滴度更高。采用非競爭ELISA方法和BIAcore方法檢測親和力。采用非競爭ELISA固相法,Sf9細(xì)胞表達(dá)全抗的解離常數(shù)分別為1.06×10-8M、2.61×10-9M、2.50×10-10M,293T細(xì)胞表達(dá)全抗的解離常數(shù)分別為1.42×10-10M、1.61×10-10M、1.47×10-10M、3.57×10-10M,CHO-12-5的解離常數(shù)為1.93×10-10M。采用BIAcore法,Sf9細(xì)胞表達(dá)全抗的解離常數(shù)分別為5.80×10-8M、1.20×10-6M、5.47×10-9M,293T細(xì)胞表達(dá)全抗的解離常數(shù)分別為3.75×10-9M、9.53×10-9M、7.50×10-9M、7.75×10-9M。結(jié)果顯示IgG3具有較高的親和力,兩種表達(dá)系統(tǒng)未顯示出親和力的差異而兩種親和力檢測方法之間,較之ELISA方法的終點定量檢測,Biacore法無須標(biāo)記并且可以實時監(jiān)測抗原抗體結(jié)合的速度、強(qiáng)度、特異性、穩(wěn)定性和結(jié)合量等詳細(xì)信息,說服力更好更保守。兩種親和力測定方法比較同一株抗體分別采用Sf9細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)和293T細(xì)胞瞬時表達(dá)的差異,發(fā)現(xiàn)KD值相差一個數(shù)量級,可能是兩種方法敏感性不同,有待于的進(jìn)一步測定。本研究純化出IgG3人源抗體,如果按優(yōu)化比例和重組乙肝表面抗原組成抗原抗體復(fù)合物,或許會取得較好的治療效果,亟待進(jìn)一步實驗結(jié)果的研究。
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R392.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 任貴方,阮薇琴,田淑芳,梅雅芳,阮力,楊安道,楊芙蓉,王申,王秀平,朱既明;乙型肝炎病毒表面抗原主蛋白基因轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的建立與細(xì)胞性質(zhì)的研究[J];病毒學(xué)報;1991年02期

2 張世珍,梁米芳,鄭海發(fā),李維,董關(guān)木,侯云德;人源抗狂犬病毒中和性全抗體在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)[J];病毒學(xué)報;2001年03期

3 朱莉莉;李川;李建東;孫麗娜;梁米芳;李德新;;抗體重鏈可變區(qū)框架I區(qū)對抗體分泌的影響[J];病毒學(xué)報;2008年03期

4 汪萱怡;聞玉梅;;以臨床-實驗室-臨床模式研究抗原-抗體復(fù)合物型治療性乙型肝炎疫苗[J];傳染病信息;2010年04期

5 管孝鞠,吳玉章,賈正才,石統(tǒng)東,唐艷;乙肝治療性多肽免疫刺激復(fù)合物的制備及鑒定[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2000年10期

6 聞玉梅,何麗芳,瞿滌,馬張妹,姚忻;重組治療性乙型肝炎疫苗(YIC)的實驗研究[J];中國工程科學(xué);1999年01期

7 汪萱怡;;乙型肝炎治療性疫苗研究進(jìn)展[J];世界臨床藥物;2009年06期

8 莊輝;乙型肝炎流行病學(xué)研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué).流行病學(xué)傳染病學(xué)分冊;2004年03期

9 苗向陽;基因工程抗體的研究進(jìn)展[J];中國畜牧獸醫(yī);2003年04期

10 唐碧霞,馬馳;治療性抗體的現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J];國外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊);2005年05期

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1 張黎;人源抗EV71病毒基因工程抗體的研究[D];中國疾病預(yù)防控制中心;2011年

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本文編號：2526221