【摘要】：目的：本研究旨在以ASP-1重組蛋白作為一種新型生物佐劑,利用其佐劑活性進(jìn)行H5N1病毒新型疫苗研究,發(fā)展具有良好免疫原性和免疫保護(hù)效果的H5N1病毒新型疫苗。 方法：本研究首先在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)ASP-1截短片段,利用原核系統(tǒng)表達(dá),獲得作為佐劑的ASP-1重組蛋白,研制了兩種H5N1病毒重組疫苗,一是參照H5N1病毒A/Vietnam/1194/2004株HA抗原序列,經(jīng)密碼子優(yōu)化后,利用昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)進(jìn)行HA重組抗原的表達(dá)與純化。將獲得的ASP-1重組蛋白作為佐劑或使用常規(guī)氫氧化鋁佐劑制備HA重組疫苗,免疫BALB/c小鼠后對(duì)疫苗的免疫原性和免疫保護(hù)效果進(jìn)行檢測(cè)和評(píng)價(jià)。二是通過(guò)對(duì)H5N1病毒M2蛋白進(jìn)行保守性分析,獲得M2蛋白胞外區(qū)(M2e)共有序列。以此為靶抗原分子,設(shè)計(jì)由pET32a載體蛋白trxA與3個(gè)串聯(lián)的M2e分子融合表達(dá)的疫苗分子,利用原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行融合蛋白的重組表達(dá)與純化,并將純化后的重組蛋白命名為TrxA-M2e3。以ASP-1重組蛋白作為佐劑免疫BALB/c小鼠,檢測(cè)重組疫苗免疫原性并通過(guò)攻毒保護(hù)性試驗(yàn)評(píng)價(jià)疫苗對(duì)不同進(jìn)化分支H5N1病毒的交叉保護(hù)效果。 結(jié)果結(jié)論：本研究成功實(shí)現(xiàn)了ASP-1佐劑蛋白、HA重組抗原和TrxA-M2e3重組蛋白的表達(dá)。以重組表達(dá)的ASP-1蛋白作為佐劑,低劑量的HA重組疫苗可以誘導(dǎo)高滴度的抗原特異性抗體,并可使免疫小鼠在致死劑量H5N1病毒攻擊時(shí)獲得完全免疫保護(hù)。重組表達(dá)的TrxA-M2e3蛋白應(yīng)用ASP-1佐劑免疫小鼠同樣可以誘導(dǎo)高滴度抗體,并可有效發(fā)揮針對(duì)不同進(jìn)化分支H5N1病毒的交叉保護(hù)作用。應(yīng)用ASP-1作為佐劑進(jìn)行的疫苗免疫結(jié)果表明ASP-1重組蛋白具有良好的佐劑活性,有效增強(qiáng)疫苗的免疫原性,并且可產(chǎn)生Th1偏移的免疫反應(yīng)。這些研究結(jié)果表明,截短表達(dá)的ASP-1重組蛋白可作為一種良好的新型佐劑應(yīng)用于發(fā)展H5N1病毒新型疫苗。以誘導(dǎo)中和抗體的HA抗原和高度保守的M2e分子為靶抗原,結(jié)合ASP-1蛋白佐劑活性可以發(fā)展出具有良好免疫原性和免疫保護(hù)效果的H5N1病毒新型疫苗。
【圖文】：

2佐劑蛋白ASP一1的設(shè)計(jì)與制備2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果23.1ASP一1蛋白抗原表位預(yù)測(cè)利用恤p://tools.immuneepitope.o嗯/t0015/beell/iedb--input網(wǎng)站提供的抗原表位在線分析軟件對(duì)ASP一1抗原表位區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)。將預(yù)測(cè)出的表位區(qū)按評(píng)分大小排列，結(jié)果顯示第16一22位氨基酸殘基的抗原表位得分最高(圖1)。提示ASP一1全長(zhǎng)蛋白前22位氨基酸殘基含有抗原優(yōu)勢(shì)表位。致致巴吮巍巍怒蟋巍滋政橄匆..日..口暇噢翻圈...

2.3.3表達(dá)質(zhì)粒pQE30一ASP一1的構(gòu)建及鑒定根據(jù)實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的引物PCR擴(kuò)增ASP一 167一660bp位堿基的截短片段，命名為AsP一1。如圖3A所示，，PcR擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符合(大小約為594bp)的目的片段。T載體與截短的ASP一1基因連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，命名為pMD18一Ts一ASP一1。用BamHI、Hindlll雙酶切AsP一1基因并克隆至pQE30表達(dá)載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pQE30一ASP一1。經(jīng)BamHI、Hindlll雙酶切鑒定(圖3B)和DNA測(cè)序鑒定，證實(shí)截短表達(dá)ASP一1重組蛋白的重組表達(dá)質(zhì)粒pQE3O一ASP一1構(gòu)建成功。
【學(xué)位授予單位】：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 金元昌,李景鵬,張龍,孫岳,于敏,楊甲芳;禽流感病毒分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2003年01期

本文編號(hào)：2525061