【摘要】：目的：建立一種溫度敏感型干細(xì)胞系,研究其在亞低溫(33℃)和正常體溫(37℃)兩種環(huán)境下的增殖與分化特點(diǎn),同時(shí)利用BDNF的營養(yǎng)和誘導(dǎo)作用增加移植干細(xì)胞向神經(jīng)元方向的分化比例,為腦外傷患者接受亞低溫治療期間實(shí)施干細(xì)胞原位移植打下基礎(chǔ)。 方法：采用原代細(xì)胞貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)人源性UCMSCs,流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行表面標(biāo)記蛋白鑒定,體外誘導(dǎo)其向神經(jīng)細(xì)胞分化。用含溫度敏感性猿猴病毒40大T抗原(tsSV40LT)的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染UCMSCs, PCR檢測外源基因的整合,繪制其在33℃和37℃培養(yǎng)條件下的細(xì)胞生長曲線；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期,PCR-ELISA端粒酶檢測法檢測端粒酶活性,Western Blot法檢測細(xì)胞周期調(diào)控蛋白---cyclin D1、CDK2和P16蛋白的表達(dá)；血清依賴實(shí)驗(yàn)及軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測該細(xì)胞系在兩種溫度下的致瘤潛能；利用腺病毒載體轉(zhuǎn)染BDNF進(jìn)入U(xiǎn)CMSCs, ELISA方法測定BDNF分泌時(shí)相,免疫熒光方法檢測轉(zhuǎn)染與非轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)NSE和GFAP的比例；建立去胸腺小鼠顱腦液壓打擊模型進(jìn)行干細(xì)胞原位移植,腦組織標(biāo)本行增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)免疫組化及原位細(xì)胞凋亡檢測,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物予以神經(jīng)功能缺陷評分。 結(jié)果：利用原代貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法成功獲得UCMSCs,流式細(xì)胞結(jié)果符合UCMSCs特征,經(jīng)體外條件誘導(dǎo),UCMSCs可表達(dá)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白；PCR結(jié)果顯示tsSV40LT抗原的基因片段被成功整合入干細(xì)胞,端粒酶活性高,cyclin D1和CDK2高表達(dá),P16低表達(dá),并高表達(dá)nestin,不表達(dá)NSE和GFAP,同時(shí)該細(xì)胞系在33℃時(shí)增殖旺盛,可耐受極低的營養(yǎng)條件,并可在軟瓊脂中形成小的細(xì)胞克隆；在37℃條件下細(xì)胞增殖緩慢甚至停滯,端粒酶活性低,cyclin D1和CDK2的表達(dá)強(qiáng)度明顯低于33℃條件,P16則相反,與此同時(shí)nestin表達(dá)強(qiáng)度明顯下降,NSE和GFAP表達(dá)水平上升,低營養(yǎng)耐受力下降,無細(xì)胞克隆形成；BDNF的表達(dá)水平于病毒轉(zhuǎn)染后第72h達(dá)到高峰,此期干細(xì)胞NSE陽性細(xì)胞比例明顯增多(P0.05),相反GFAP陽性細(xì)胞比例下降；動(dòng)物體內(nèi)結(jié)果顯示,亞低溫治療期間的腦組織高表達(dá)PCNA,凋亡細(xì)胞少見；常溫組腦組織則低表達(dá)PCNA,創(chuàng)傷灶周邊見較多凋亡細(xì)胞存在。 結(jié)論： (1)借助tsSV40LT抗原建立的溫度敏感型UCMSCs細(xì)胞系,在細(xì)胞增殖和1分化方面具有顯著的溫度可調(diào)控性特征,即在其適宜溫度下(33℃)增殖能力旺盛,并維持在前體細(xì)胞水平,極少產(chǎn)生細(xì)胞分化；當(dāng)其處于37℃環(huán)境中時(shí)則停止增長,轉(zhuǎn)而分化為神經(jīng)細(xì)胞； (2)溫度敏感型UCMSCs細(xì)胞系在其適宜溫度下存在一定的致瘤性(對低營養(yǎng)環(huán)境的高耐受力和半固體介質(zhì)中的強(qiáng)克隆形成能力),但當(dāng)其處于非適宜溫度(37℃)下則幾乎完全失去了增殖能力,也不再具有致瘤性。其潛在致瘤性可以通過改變溫度得到有效控制； (3)常溫條件下在腦創(chuàng)傷及其近緣部位移植的干細(xì)胞,絕大部分因?yàn)椴荒褪軇?chuàng)傷灶半損傷帶的低營養(yǎng)、高毒素環(huán)境而死亡；但在亞低溫環(huán)境中,在創(chuàng)傷灶半損傷帶移植溫度敏感型的UCMSCs,可見存活的細(xì)胞顯著增多,同時(shí)凋亡減少,動(dòng)物神經(jīng)功能得到有效恢復(fù)； (4)通過對干細(xì)胞進(jìn)行BDNF基因轉(zhuǎn)染可增加干細(xì)胞向神經(jīng)元而非神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化比例,結(jié)合其自身的神經(jīng)營養(yǎng)作用,進(jìn)一步提高干細(xì)胞恢復(fù)創(chuàng)傷后神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能的潛能。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2523308