【摘要】：波長為280-320nm的UVB是紫外線誘導(dǎo)細胞發(fā)生光損傷反應(yīng)的關(guān)鍵致傷因素。UVB除了能在基因水平誘導(dǎo)DNA損傷反應(yīng)之外,細胞中一系列炎性因子的分泌和表達也是UVB誘導(dǎo)細胞損傷反應(yīng)的重要介導(dǎo)因素。其中血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)由于具有促進血管發(fā)生、增加血管通透性、促進脈管生成等作用,因此在過度UVB暴露引發(fā)的以皮膚紅斑、水腫、脫皮等為主要特征的急性光損傷反應(yīng)以及以皮膚衰老進程加快、皮膚癌發(fā)生和發(fā)展等為主要特征的慢性光損傷反應(yīng)中具有重要的作用。盡管目前人們對UVB如何實現(xiàn)VEGF誘導(dǎo)表達的胞內(nèi)分子機制的認識還十分有限,但拮抗VEGF的表達上調(diào)能夠顯著抑制皮膚組織對UVB的光損傷反應(yīng)敏感性。因此,揭示UVB誘導(dǎo)VEGF表達的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和分子機制在防治UVB引發(fā)的一系列急、慢性光損傷反應(yīng)中具有重要的科學(xué)意義和醫(yī)學(xué)價值。 本論文主要研究UVB刺激作用下,小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblasts ,MEFs)中VEGF誘導(dǎo)表達的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。目前,有關(guān)UVB反應(yīng)中VEGF誘導(dǎo)表達理論分為直接型和間接型兩種。所謂直接型指UVB刺激通過轉(zhuǎn)錄因子的作用直接引起VEGF表達上調(diào);間接型指在UVB刺激作用下,通過TNFα介導(dǎo)VEGF的表達,但這一過程中似乎并不涉及TNFα與其受體的結(jié)合。下面我們分別對這兩種理論進行探討。 在第一部分研究中發(fā)現(xiàn),UVB能夠上調(diào)MEFs細胞中vegf基因啟動子活性、并在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平實現(xiàn)對VEGF的誘導(dǎo)表達。同時我們確定了IKK激酶的催化亞基IKKα在這一過程中的關(guān)鍵作用,并且IKKα可不依賴于IKKα和NF-αB獨立介導(dǎo)UVB誘導(dǎo)的VEGF表達。隨后,通過生物信息學(xué)軟件對小鼠vegf啟動子區(qū)域進行分析,發(fā)現(xiàn)vegf啟動子區(qū)存在3個轉(zhuǎn)錄因子AP-1的潛在結(jié)合位點。進一步研究發(fā)現(xiàn),AP-1正是位于IKKα下游參與UVB誘導(dǎo)VEGF表達的關(guān)鍵蛋白分子,并且c-Jun和c-Fos是組成UVB誘導(dǎo)活化的AP-1的重要功能亞基,此過程不涉及在腫瘤細胞VEGF誘導(dǎo)表達過程中具有重要作用的HIF1α的參與。由于IKKα與AP-1均在UVB誘導(dǎo)VEGF表達的過程中發(fā)揮作用,因此,我們進一步探討了IKKα與AP-1之間可能存在的功能聯(lián)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn),IKKα的存在是實現(xiàn)UVB刺激作用下c-Fos誘導(dǎo)表達的關(guān)鍵調(diào)控因素,c-Fos能與c-Jun形成AP-1異源二聚體并結(jié)合于vegf啟動子區(qū)域的AP-1結(jié)合位點,從而實現(xiàn)對VEGF誘導(dǎo)表達的調(diào)控作用。以上結(jié)果確定了IKKα/c-Fos/AP-1信號通路在介導(dǎo)UVB誘導(dǎo)VEGF表達過程中的重要作用。 根據(jù)目前最新的研究線索,IKKα與IKKα在發(fā)揮功能效應(yīng)過程中的關(guān)鍵區(qū)別在于IKKα具有組成性的核定位功能,它能夠直接結(jié)合于NF-αB靶基因啟動子區(qū)域并通過催化組蛋白的磷酸化反應(yīng),從而實現(xiàn)對NF-αB靶基因誘導(dǎo)表達的調(diào)控作用。那么在UVB誘導(dǎo)VEGF表達過程中是否涉及IKKα的這種類似功能模式呢α我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),UVB能有效誘導(dǎo)核內(nèi)IKKα活化,同時活化型IKKα能與共定位于細胞核的c-Fos發(fā)生相互作用。通過染色質(zhì)免疫沉淀實驗,我們分析了IKKα能否結(jié)合于vegf啟動子區(qū)域。結(jié)果顯示,UVB刺激作用下,IKKα和c-Fos均能夠結(jié)合于vegf啟動子區(qū)域的3個潛在的AP-1結(jié)合位點。而這種染色質(zhì)DNA結(jié)合能力正是IKKα發(fā)揮核激酶功能的關(guān)鍵前提。進一步的研究發(fā)現(xiàn),IKKα能夠通過催化vegf啟動子上AP-1結(jié)合位點區(qū)域的組蛋白H3發(fā)生磷酸化修飾反應(yīng),從而上調(diào)UVB刺激作用下VEGF的誘導(dǎo)表達水平,發(fā)揮協(xié)同基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用。此部分研究結(jié)果揭示了IKKα參與UVB反應(yīng)中VEGF誘導(dǎo)表達的新途徑。這不僅為IKK/NF-κB信號通路的基礎(chǔ)理論研究提供了創(chuàng)新性的研究發(fā)現(xiàn),同時,也首次揭示了IKKα不依賴于IKKα獨立介導(dǎo)細胞炎性損傷效應(yīng)的新模式。 p85α是組成PI-3K蛋白激酶中一種重要的調(diào)節(jié)亞基。由于各種細胞中p85α表達豐度遠遠超過PI-3K催化亞基p110,因此p85α除了能與p110形成異源二聚體而發(fā)揮PI-3K激酶活性以外,單體型p85α也被推斷具有獨立的生物學(xué)功能。本課題組在以往的研究中發(fā)現(xiàn):p85α可不依賴于PI-3K激酶活性通過激活NFAT-TNFα信號通路介導(dǎo)UVB誘導(dǎo)的細胞凋亡反應(yīng)。那么由p85α介導(dǎo)產(chǎn)生的TNFα是否能夠通過間接機制參與VEGF的誘導(dǎo)表達呢α因此,在第二部分研究中,我們對以上假設(shè)進行了探索。結(jié)果發(fā)現(xiàn),p85α能介導(dǎo)UVB刺激作用下VEGF的誘導(dǎo)表達,轉(zhuǎn)錄因子NFAT3是p85α介導(dǎo)這一過程中的下游關(guān)鍵信號分子,TNFα的誘導(dǎo)表達也參與了UVB刺激作用下VEGF的表達。以上結(jié)果表明,VEGF在UVB刺激作用下也能夠通過p85α/NFAT/TNFα信號通路實現(xiàn)誘導(dǎo)表達。本部分研究結(jié)果初步揭示了單體型p85α在細胞炎性損傷效應(yīng)中的作用機制,使單體型p85α的效應(yīng)機制研究首次從細胞生存與凋亡調(diào)控擴展到炎性反應(yīng)。綜上所述,本論文研究結(jié)果揭示了UVB誘導(dǎo)VEGF表達的兩條新型胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,同時闡明了IKKα和p85α這兩種重要的信號蛋白分子在VEGF誘導(dǎo)表達過程中的新模式。以上研究結(jié)果為與VEGF相關(guān)的紫外線損傷防御策略提供了新的依據(jù)和思路。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R363

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