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人乳頭瘤病毒58型(HPV58)E2蛋白與E7蛋白的直接相互作用及效果研究

發(fā)布時(shí)間:2019-07-09 13:39
【摘要】:目的和意義:人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)屬乳多空病毒科A組,為嗜上皮組織的小DNA病毒。目前,人們已經(jīng)成功分離出了120多個(gè)型別的HPV。根據(jù)致病性的不同,又可將其分為低危型和高危型。低危型包括HPV-1、2、6、11等,主要引起良性瘤或疣,如扁平疣和尖銳濕疣;高危型包括HPV-16、18、31、45、58等,可以導(dǎo)致惡性腫瘤,是宮頸癌的主要病因之一。 HPV-58是一種重要的高危型HPV,它的流行存在地域差異。流行病學(xué)研究表明,HPV-58的感染主要分布在亞洲,尤其是東亞地區(qū),因此歐美學(xué)者對(duì)其關(guān)注較少。我國(guó)各地區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查顯示,無論在宮頸篩查,還是宮頸癌患者中,HPV-58的感染率都僅次于HPV-16和18,有些地區(qū)甚至超過HPV-18。但是對(duì)HPV-58的病毒生物學(xué)及致癌活性的研究卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于HPV-16和18。目前,針對(duì)HPV-16和18型病毒的疫苗已經(jīng)上市,但卻不能保護(hù)HPV-58的感染。因此,對(duì)HPV-58的研究具有很強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義。 HPV基因組全長(zhǎng)8kb左右,可分為3個(gè)區(qū):長(zhǎng)調(diào)控區(qū)(long control region, LCR)、早期基因區(qū)(編碼早期調(diào)控蛋白E1、E2、E4、E5、E6、E7)和晚期基因區(qū)(編碼衣殼蛋白L1和L2)。E6和E7是主要的癌蛋白,其致癌機(jī)制已經(jīng)比較清楚,且功能較為保守。而E2蛋白是病毒的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白,功能較為復(fù)雜,不僅可以調(diào)節(jié)E6和E7的轉(zhuǎn)錄,還可以和多種宿主蛋白相互作用。最引人注目的是E2蛋白可以抑制E6/E7的表達(dá),從而抑制細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化,但在病毒基因組整合的過程中,常伴隨E2基因的破壞,特別在宮頸癌組織中E2常常缺失。因此,E2蛋白的缺失被認(rèn)為是宮頸損傷由良性轉(zhuǎn)為惡性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)折點(diǎn)。然而,E2的功能較復(fù)雜,目前還不是清楚其在病毒生活周期中究竟扮演什么角色。其研究結(jié)果也主要來自于HPV-16E2和BPVE2。 因此,本研究以HPV-58E2蛋白作為研究對(duì)象,試圖深入了解58E2蛋白在抑癌方面的分子機(jī)制,為進(jìn)一步研究基于E2蛋白的宮頸癌治療性疫苗奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法和結(jié)果:本研究應(yīng)用GST-pull down發(fā)現(xiàn)了HPV-58E2蛋白可以和E7蛋白在細(xì)胞外結(jié)合,并應(yīng)用免疫共沉淀進(jìn)一步驗(yàn)證二者在細(xì)胞內(nèi)的直接相互作用。同時(shí),我們還發(fā)現(xiàn),E2和E7蛋白在細(xì)胞內(nèi)的結(jié)合具有HPV型別特異性,即58E2只能與58E7結(jié)合,卻不能結(jié)合16E7;同樣,16E2也只能和16E7結(jié)合,但不能結(jié)合58E7。為了進(jìn)一步確定58E2和E7結(jié)合的結(jié)構(gòu)域,我們構(gòu)建了一系列58E2的截短型突變體,應(yīng)用免疫共沉淀分別檢測(cè)它們與58E7是否存在直接相互作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn),58E2的N端和C端都不能結(jié)合58E7,只有中間的鉸鏈區(qū),特別是其中244-254aa是58E2和58E7結(jié)合的關(guān)鍵部位。 在此基礎(chǔ)上,我們進(jìn)一步研究了58E2和58E7的結(jié)合對(duì)58E7致癌活性的影響。因?yàn)镠PV E7蛋白結(jié)合并降解抑癌蛋白pRb是其致癌的主要機(jī)制之一,所以首先檢測(cè)了58E2是否會(huì)抑制58E7對(duì)pRb的降解。我們應(yīng)用E2全長(zhǎng)蛋白和58E2的各截短型突變體分別和58E7共轉(zhuǎn)染HaCat和NIH3T3細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞中pRb的穩(wěn)定水平。結(jié)果證明不僅58E2全長(zhǎng)蛋白可以抑制pRb的降解,包含鉸鏈區(qū)的58E2各截短型突變體都可以不同程度地保護(hù)pRb不被58E7降解。接下來又通過免疫共沉淀法檢測(cè)58E2和58E7相互作用是否會(huì)抑制58E7與pRb的結(jié)合,分別用58E2NT和缺失pRb結(jié)合位點(diǎn)的58E7突變體58E7△22-26作為對(duì)照。結(jié)果顯示,野生型58E7和58E7Δ22-26結(jié)合58E2的能力無明顯差別,而58E2不會(huì)抑制58E7與pRb結(jié)合。此外,我們還通過細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了58E2對(duì)58E7誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),包含鉸鏈區(qū)的突變體和全長(zhǎng)58E2都可以抑制58E7誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖。 結(jié)論:①HPV-58E2和E7蛋白存在直接相互作用,58E2鉸鏈區(qū)是結(jié)合58E7的關(guān)鍵部位;②E2-E7的結(jié)合表現(xiàn)出HPV型別特異性;③HPV-58E2蛋白抑制58E7介導(dǎo)的pRb的降解,進(jìn)而抑制58E7誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖活性。 目的:卡波氏肉瘤相關(guān)病毒(Kaposi's sarcoma associated herpesvirus, KSHV)屬于γ型皰疹病毒,為有包膜的雙鏈大DNA病毒。是目前所知的七種人類致瘤病毒之一。KSHV可以致卡波氏肉瘤和初級(jí)融合淋巴結(jié)瘤,常見于艾滋病患者。KSHV病毒顆粒由三層蛋白組成:衣殼、被膜和包膜,由內(nèi)到外包裹病毒DNA。大部分病毒蛋白位于被膜層,目前已被鑒定的有ORF11、21、23、33、45、52、63、64、75等。 脂筏是動(dòng)態(tài)細(xì)胞膜系統(tǒng)中的一部分,廣泛參與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),免疫應(yīng)答,病毒的感染、組裝和釋放等多種細(xì)胞的生命活動(dòng)。越來越多的的研究發(fā)現(xiàn)許多包膜病毒的結(jié)構(gòu)蛋白可以定位于脂筏,隨著脂筏的運(yùn)動(dòng)而聚集和運(yùn)輸,參與病毒顆粒的組裝和釋放。由此,我們推測(cè)KSHV可能也以脂筏作為病毒組裝釋放的平臺(tái)。 ORF45編碼一個(gè)407aa的被膜蛋白。僅存在于γ型皰疹病毒中。ORF45不僅可以和多種被膜蛋白相互作用,還可以結(jié)合衣殼蛋白和包膜蛋白,它更像是一個(gè)病毒結(jié)構(gòu)的組織者。我們以前的研究發(fā)現(xiàn),應(yīng)用敲除了ORF45的KSHV人工基因組轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,病毒顆粒的釋放明顯低于野生型KSHV人工基因組。綜合以往的研究,我們推測(cè)ORF45在病毒的組裝釋放過程中一定起著重要的作用。因此,本研究試圖從ORF45與脂筏的關(guān)系入手,探討ORF45以脂筏為平臺(tái),組織病毒顆粒的組裝和釋放的機(jī)制。 方法和結(jié)果:目前。研究脂筏最常用的方法是在低溫(4℃)條件下,應(yīng)用非離子性去污劑分離出抵抗去污劑的細(xì)胞膜成分(detergent resistant membrane, DRM),以DRM研究脂筏相關(guān)蛋白。我們首先應(yīng)用KSHV潛伏感染的BCBL-1細(xì)胞,經(jīng)TPA誘導(dǎo)病毒裂解復(fù)制,提取DRM檢測(cè)ORF45。結(jié)果顯示,ORF45蛋白可以定位于DRM。為了進(jìn)一步證明,ORF45是自發(fā)性的定位于脂筏,而不是通過與其它病毒蛋白相互作用定位于脂筏的。我們?cè)?93T細(xì)胞中過表達(dá)ORF45,提取脂筏依然可以檢測(cè)到ORF45。接下來,我們構(gòu)建了一系列ORF45的突變體,檢測(cè)它們與脂筏的關(guān)系,最終發(fā)現(xiàn)決定脂筏定位的結(jié)構(gòu)域位于115-332aa,其中297-300aa是脂筏定位的關(guān)鍵位點(diǎn)。 之后,我們應(yīng)用野生型和ORF45缺陷型的KSHV人工基因組轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系,并向ORF45缺陷型的KSHV細(xì)胞系中導(dǎo)入ORF45野生型和突變體的表達(dá)質(zhì)粒,再用TPA和Butyrate誘導(dǎo)KSHV裂解復(fù)制。收集并純化培養(yǎng)上清中的病毒顆粒。經(jīng)Real-time PCR分析病毒基因組拷貝數(shù),結(jié)果顯示,缺失ORF45的KSHV的病毒基因組拷貝數(shù)明顯低于野生型的KSHV,僅為野生型的1/10~1/8。但重新導(dǎo)入ORF45后,病毒基因組拷貝數(shù)較ORF45缺陷型明顯升高,然而,轉(zhuǎn)染不同的ORF45突變體,病毒基因組的拷貝數(shù)不同,尤其是脂筏定位區(qū)缺陷組與ORF45缺失組沒有明顯差別。 有研究發(fā)現(xiàn),ORF45可以和核糖體S6激酶(ASK)相互作用,激活ERK信號(hào)通路。而且脂筏又廣泛參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此,我們還檢測(cè)了ORF45的各突變體與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)系。結(jié)果顯示,除了ORF45的19-77aa與ASK相互作用,可以維持ERK的磷酸化,其它結(jié)構(gòu)域(包括脂筏定位結(jié)構(gòu)域)和ERK的磷酸化無關(guān)。 結(jié)論:①KSHV被膜蛋白ORF45是一個(gè)脂筏相關(guān)蛋白,其脂筏定位的關(guān)鍵位點(diǎn)位于297-300aa。②ORF45在KSHV的組裝和釋放過程中發(fā)揮重要作用,ORF45很可能以脂筏為平臺(tái),組織病毒顆粒的組裝與釋放。③ORF45定位于脂筏與細(xì)胞內(nèi)ERK信號(hào)通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)無關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】:山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:博士
【學(xué)位授予年份】:2012
【分類號(hào)】:R373.9

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào):2512181

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