【摘要】：類風濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種以慢性滑膜炎癥、關(guān)節(jié)軟骨侵蝕為特征的自身免疫性疾病,發(fā)病機制未明。Ⅱ型膠原蛋白(typeⅡcollagen, CⅡ)是軟骨基質(zhì)的主要有機成分,由3條相同的α1(Ⅱ)鏈組成。近年來研究表明,類風濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病與CⅡ誘導的自身免疫應答有關(guān),在10%-30%的RA患者血清和關(guān)節(jié)滑液可檢測到抗天然和變性CⅡ抗體,用CⅡ免疫某些動物可誘導出實驗性關(guān)節(jié)炎,口服CⅡ誘導免疫耐受對類風濕性關(guān)節(jié)炎有顯著的療效。但是研究結(jié)果差別很大,在抗CⅡ自身抗體的產(chǎn)生和誘導免疫耐受的機制方面研究進展緩慢,極大地限制了CⅡ的臨床實際應用。主要影響因素包括：(1)CⅡ的來源和提取方法；(2)CⅡ抗體檢測條件；(3)CⅡ的生物學特性、消化酶對其的作用；(4)口服CⅡ的劑量、劑型和機體胃腸道黏膜的免疫狀態(tài)等。在本研究中,我們通過選擇分離條件,建立了從雞胸箭突軟骨中提取和純化CⅡ的可靠方法,對CⅡ的生物學特性進行了系統(tǒng)分析；優(yōu)化實驗條件,建立了血清抗CⅡ抗體的ELISA檢測法,并探討其在類風濕性關(guān)節(jié)炎的應用價值；體外研究各種消化酶對CⅡ的水解片段,體內(nèi)經(jīng)口服觀察機體特異性IgG、IgA、IgM抗體的產(chǎn)生水平和對派氏集合淋巴結(jié)細胞因子表達的影響,探討口服CⅡ誘導免疫耐受的可能性和對類風濕性關(guān)節(jié)炎干預的可能機制。 第一部分Ⅱ型膠原蛋白的提取和純化 目的：優(yōu)化實驗條件,建立提取和純化Ⅱ型膠原蛋白的可靠方法。 方法：選擇雞胸箭突軟骨為提取原料,用鹽酸胍去除蛋白多糖,對胃蛋白酶的消化方式、氯化鈉鹽析濃度、DEAE陰離子樹脂種類進行研究,采用SDS-PAGE對CⅡ進行鑒定。 結(jié)果：雞胸箭突前處理方便,其軟骨勻漿液主要含有CⅡ在內(nèi)的4種蛋白質(zhì)。4 mol/L鹽酸胍能有效去除蛋白多糖；采用分步消化方式、控制反應溫度在4℃、消化后的膠原蛋白溶液迅速調(diào)節(jié)到pH7.5等措施能獲得滿意的限制性酶解結(jié)果；氯化鈉鹽析濃度為2.4mol/L時最佳。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示提取純化的CⅡ與Sigma公司的產(chǎn)品一致,亞基分子量約為120kD。 結(jié)論：改進后的方法具有材料廣泛、實驗條件簡便、結(jié)果可靠等優(yōu)點,適用于科研、臨床等各種規(guī)模CⅡ的提取。 第二部分Ⅱ型膠原蛋白的生物學特性研究 目的：研究CⅡ的物理化學特性、抗體產(chǎn)生規(guī)律和免疫反應性。 方法：用光譜法測定CⅡ吸收峰和等電點、HPLC法檢測CⅡ氨基酸組成、烏氏黏度計測定不同條件下CⅡ溶液的增比黏度。SDS-PAGE法測定分子量,結(jié)合免疫印跡法分析CⅡ和熱變性CⅡ(denatured typeⅡcollage, D-CⅡ)的免疫反應性。用CⅡ免疫新西蘭白兔,每隔10天收集血清,以改良間接ELISA法檢測抗CⅡ抗體效價。 結(jié)果：SDS-PAGE電泳顯示CⅡ有α、β和γ三條區(qū)帶,都能與抗CⅡ抗體發(fā)生特異性反應,α亞基分子量約120kD；D-CⅡ含有10多條免疫印跡反應呈陽性的片段。CⅡ溶液的最大吸收峰為230nm,等電點pH值約6.25。氨基酸組成中,甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸含量高,芳香族氨基酸低。CⅡ溶液的增比黏度隨濃度的增加而增加,在25～45℃范圍內(nèi)隨著溫度的升高逐漸下降。Ⅱ型膠原蛋白免疫新西蘭白兔后,經(jīng)ELISA檢測,在免疫的第10天抗體效價達1：3200,第20天升至1：204800；加強免疫后,第30天和第40天抗體效價分別達到1：409600和1：819200。 結(jié)論：Ⅱ型膠原蛋白具有獨特的理化性質(zhì),因富含脯氨酸故具有較強的免疫原性,免疫新西蘭白兔后獲得高效價的CⅡ血清。 第三部分血清抗Ⅱ型膠原蛋白抗體檢測法的建立與應用 目的：建立血清抗Ⅱ型膠原蛋白抗體的ELISA檢測法,探討其在類風濕性關(guān)節(jié)炎診斷和治療方面的應用價值。 方法：以上述實驗提取的雞Ⅱ型膠原蛋白作為包被抗原,優(yōu)化實驗條件,建立抗Ⅱ型膠原蛋白抗體間接ELISA法。對289例RA病人和54例健康人血清抗Ⅱ型膠原蛋白抗體進行檢測。 結(jié)果：Ⅱ型膠原蛋白抗體ELISA檢測法的條件為：先用0.05 mol/L醋酸將CⅡ配成0.5 g/L儲存液,再用PH7.60.05 mol/L磷酸鹽緩沖液將CⅡ配成20μg/ml的包被液,4℃12 h進行包被,繼以10%羊血清、37℃2 h為封閉條件；用含10%羊血清的緩沖液分別將血清作1：50稀釋、酶標抗體作1：2000稀釋；采用雙波長450nm/630 nm進行測定。采用建立的方法,發(fā)現(xiàn)RA患者和健康人血清抗Ⅱ型膠原蛋白抗體陽性率分別為19.38%和1.85%,兩組有明顯的統(tǒng)計學差異(P0.01)。 結(jié)論：CⅡ可以作為血清抗Ⅱ型膠原蛋白抗體ELISA法的包被抗原；用含10%羊血清的緩沖液對酶標反應板進行封閉和對血清標本、酶標抗體進行稀釋,可以有效地阻止非特異性吸附,提高結(jié)果的重復性和特異性�？耿蛐湍z原蛋白抗體可作為判斷RA患者病情的一個輔助診斷指標。 第四部分消化酶對Ⅱ型膠原蛋白作用的體內(nèi)外研究 目的：體外觀察消化酶對天然Ⅱ型膠原蛋白(native typeⅡcollage,N-CⅡ)和變性Ⅱ型膠原蛋白(D-CⅡ)的酶解作用；小鼠和大鼠胃腸道給予CⅡ探討口服Ⅱ型膠原蛋白對類風濕性關(guān)節(jié)炎可能的干預機制。 方法：在體外將胃蛋白酶、胰蛋白酶和α-糜蛋白酶分別作用于N-CⅡ和D-CⅡ,采用SDS-PAGE電泳和免疫印跡法分析酶解產(chǎn)物。將N-CⅡ和D-CⅡ注入鼠胃和十二指腸內(nèi),在不同時間收集胃和腸內(nèi)容物,進行SDS-PAGE電泳分析。 結(jié)果：CⅡ在胃、腸道能處于溶解狀態(tài)。在體外,N-CⅡ在胃蛋白酶和糜蛋白酶作用下電泳和免疫印跡圖譜無變化,而被胰蛋白酶作用后出現(xiàn)10條免疫印跡為陽性的條帶；D-CⅡ易被上述消化酶分解。N-CⅡ不被胃內(nèi)環(huán)境水解,可被腸道消化酶緩慢降解；D-CⅡ可被胃、腸道消化酶迅速分解。 結(jié)論：N-CⅡ可被胰蛋白酶水解產(chǎn)生多條活性片段,但對胃內(nèi)環(huán)境、胃蛋白酶和糜蛋白酶具有抵抗力；D-CⅡ易被胃、腸道消化酶水解。結(jié)果提示口服CⅡ誘導免疫耐受、治療類風濕性關(guān)節(jié)炎可能與CⅡ特性和胰蛋白酶對其的作用有關(guān)。 第五部分口服Ⅱ型膠原蛋白對血清抗體和派氏集合淋巴結(jié)細胞因子表達的影響 目的：探討口服Ⅱ型膠原蛋白對派[伊爾]氏集合淋巴結(jié)(PP結(jié))的形態(tài)學、細胞因子表達水平和血清特異性IgG、IgA、IgM含量的影響。 方法：連續(xù)10d給小鼠口服不同劑量的CⅡ,第11天和第21天用佐劑或CⅡ進行免疫,分別于第11天、第21天和第31天采集血液和PP結(jié)。PP結(jié)經(jīng)HE染色后,鏡下觀察其增生的情況。用熒光實時定量RT-PCR法,檢測PP結(jié)中IL-17、TNF-α、IFN-γ和TGF-β1 mRNA的水平。采用ELISA法檢測血清抗CⅡIgG、IgA、IgM的水平。 結(jié)果：口服CⅡ10d后,PP結(jié)增生活躍,高劑量組可見清晰的帽狀結(jié)構(gòu)；血清中出現(xiàn)IgA,未見IgG和IgM水平增加；IL-17、TNF-α、IFN-γmRNA的表達受到抑制。以CⅡ初次免疫后,實驗組IgA、IgM、IL-17的水平均低于對照組(p0.05或p0.01),TGF-β1的水平顯著增加(p0.05)。以CⅡ加強免疫后,高劑量組IgA的水平顯著增加(p0.05),實驗組IgM的水平仍受到抑制(p0.05或p0.01),TGF-β1的水平高于對照組(p0.05)。以佐劑免疫時PP結(jié)中細胞因子的表達與CⅡ免疫時相似,未見血清抗CⅡIgG、IgA、IgM水平的變化。 結(jié)論：口服CⅡ能使血清中產(chǎn)生特異性IgA,抑制PP結(jié)IL-17、TNF-α、IFN-γ的基因表達,對CⅡ免疫后IgA、IgM的產(chǎn)生和IL-17 mRNA的表達具有一定的抑制作用。血清特異性抗體的水平和細胞因子表達的變化的結(jié)果表明,口服CⅡ有助于誘導免疫耐受并干預類風濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展,有著潛在的類風濕性關(guān)節(jié)炎防治作用。
[Abstract]:Rheumatoid arthritis (RA) is an autoimmune disease characterized by chronic synovitis and articular cartilage erosion. Type II collagen (type II collagen, C II) is the main organic component of the cartilage matrix, and consists of three identical 1 (II) chains. In recent years, it is shown that the pathogenesis of rheumatoid arthritis is related to the autoimmune response induced by C 鈪，

本文編號：2504423