【摘要】：背景腦血管病的高發(fā)病率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率、高死亡率對(duì)人類健康的危害依然高居前位。神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs)移植被認(rèn)為是二十一世紀(jì)較具前景的醫(yī)療技術(shù),但因NSCs的來(lái)源受限、取材困難、免疫排斥、安全性和倫理學(xué)等眾多問(wèn)題使神經(jīng)干細(xì)胞的應(yīng)用受到制約,尤其是神經(jīng)干細(xì)胞的來(lái)源和移植途徑成為制約其臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。腦梗死后成體神經(jīng)干細(xì)胞的原位激活為內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞移植開(kāi)辟了新途徑,其激活機(jī)制有待闡明,前期研究發(fā)現(xiàn)腦梗死后神經(jīng)干細(xì)胞原位激活與谷氨酸(glutamate, GLu)濃度有關(guān)聯(lián)。為此,本課題擬通過(guò)體外實(shí)驗(yàn),探討谷氨酸對(duì)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖作用的影響,為進(jìn)一步研究?jī)?nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞原位激活機(jī)制提供理論依據(jù)。 本課題分兩部分： 第一部分神經(jīng)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)和鑒定方法的改良 目的體外原代培養(yǎng)SD (Sprague-Dawley)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞,對(duì)原代培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞、及其增殖和分化的細(xì)胞給予鑒定,并對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞原代培養(yǎng)和鑒定方法進(jìn)行改良。 方法體外原代培養(yǎng)SD大鼠神經(jīng)干細(xì)胞：從出生2天內(nèi)SD新生大鼠的海馬中分離和培養(yǎng)出神經(jīng)干細(xì)胞,經(jīng)過(guò)傳代,取第3代神經(jīng)干細(xì)胞球,采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)鑒定神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)志物nestin(巢蛋白)的表達(dá)；向培養(yǎng)基中添加5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-BrdU)24h后,檢測(cè)BrdU在增殖神經(jīng)干細(xì)胞中的表達(dá)；神經(jīng)干細(xì)胞在有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天,通過(guò)檢測(cè)標(biāo)志物βⅢ-tubulin、GFAP分別鑒定神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞。 結(jié)果體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞能增殖形成神經(jīng)干細(xì)胞球,其增殖的細(xì)胞可檢出神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)志物nestin;培養(yǎng)的細(xì)胞能將BrdU結(jié)合到細(xì)胞核中；改用血清培基后,神經(jīng)干細(xì)胞能分化標(biāo)志物βⅢ-tubulin陽(yáng)性的神經(jīng)元和GFAP陽(yáng)性的星型膠質(zhì)細(xì)胞。 結(jié)論1.本實(shí)驗(yàn)從SD大鼠海馬中分離和培養(yǎng)的細(xì)胞,其特異性標(biāo)志物、增殖和分化能力等方面均具備神經(jīng)干細(xì)胞的基本屬性；2.通過(guò)實(shí)驗(yàn)改良了神經(jīng)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)和鑒定方法,提高了原代培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的質(zhì)量和數(shù)量。 第二部分谷氨酸對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖作用的實(shí)驗(yàn)研究 目的利用體外原代培養(yǎng)的大鼠NSCs,探討谷氨酸對(duì)NSCs增殖作用的影響,為進(jìn)一步研究?jī)?nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞原位激活機(jī)制提供理論依據(jù)。 方法取第3代神經(jīng)干細(xì)胞,在含有不同濃度谷氨酸的無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天,采用倒置顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞活力MTT檢測(cè)兩種方法分別檢測(cè)不同濃度谷氨酸組神經(jīng)干細(xì)胞增殖情況。 結(jié)果神經(jīng)干細(xì)胞在無(wú)血清神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中,去除神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,加入不同濃度的谷氨酸繼續(xù)培養(yǎng)7天后,倒置顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞活力MTT檢測(cè)結(jié)果共同顯示低濃度谷氨酸可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖。 結(jié)論1.無(wú)血清體外培養(yǎng)條件下,低濃度谷氨酸可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖,谷氨酸最佳作用濃度為200μmol/L;2無(wú)血清體外培養(yǎng)條件下,高濃度谷氨酸可抑制神經(jīng)干細(xì)胞的增殖,并有一定的細(xì)胞毒性。
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【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2494197