【摘要】：microRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長度約為23個核苷酸的單鏈非編碼RNA,主要由RNA多聚酶Ⅱ轉錄,經核糖核酸酶Ⅲ (Drosha及Dicer)剪切形成。成熟microRNA通過堿基配對與靶基因mRNA的3'-UTR相結合,造成靶基因mRNA的降解或蛋白翻譯水平上受抑制,從而對靶基因的表達進行負向調控。microRNA參與多種生物學過程,對器官形成及組織分化均有重要作用。據(jù)目前文獻報道,至少有30余組microRNA在成人血細胞中有獨特的表達,其中多組microRNA與造血干細胞的分化有關,并且與胚胎造血中的關鍵因子相互作用,但它們在胚胎造血中的功能仍有待于進一步的探討。 為了揭示microRNA在哺乳動物胚胎造血中的作用,本文以小鼠胚胎干細胞誘導分化形成的擬胚體作為胚胎發(fā)育的模型。第一步,在先前實驗積累數(shù)據(jù)的基礎上,初步確定了在胚胎血發(fā)生中有特異性表達的候選microRNA。其次,為了驗證這些候選microRNA是否能夠調控胚胎血發(fā)生,我們首先構建了逆轉錄病毒載體,通過反轉錄病毒在小鼠胚胎干細胞中過表達候選microRNA。再次,我們構建了能在條件誘導過表達候選microRNA的小鼠胚胎干細胞系,可在擬胚體發(fā)育的特定時間段利用四環(huán)素誘導高表達候選microRNA,再利用實時熒光定量和流式細胞分析等方式檢測血發(fā)生及胚胎發(fā)育的變化情況,并對數(shù)據(jù)進行分析后得到了候選microRNA的可能調節(jié)因子及下游靶基因。這部分工作為下一步研究這些候選microRNA的作用途徑并找出它們的直接作用位點奠定了基礎。 另外,為了方便研究microRNA及其他外源性基因在人類胚胎干細胞中的作用,本文嘗試構建了條件誘導基因表達人類胚胎干細胞系。通過在Actb基因的3’UTR區(qū)域發(fā)生同源重組,導入了四環(huán)素調控啟動子,潮霉素(Hygromycine)抗性基因,定點重組酶系統(tǒng)元件(LoxP, Frt)等序列。在成功整合之后,就能夠更進一步地定點重組入外源基因并可在四環(huán)素衍生物強力霉素誘導下表達轉入的外源基因或microRNA。這個細胞系為我們研究在人類胚胎干細胞中研究基因或microRNA的功能提供了一個相當有用的工具。
[Abstract]:MicroRNA is a class of single strand non-coding RNA, with a length of about 23 nucleotides found in recent years, which is mainly transcribed by RNA polymerase II and cut by ribonuclease III (Drosha and Dicer). Mature microRNA binds to the 3'-UTR of target gene mRNA through base pairing, resulting in the degradation of target gene mRNA or the inhibition of protein translation level, thus negatively regulating the expression of target gene. MicroRNA is involved in a variety of biological processes. It plays an important role in organ formation and tissue differentiation. According to the current literature, at least 30 groups of microRNA have unique expression in adult blood cells, among which many groups of microRNA are related to the differentiation of hematopoietic stem cells and interact with key factors in embryonic hematopoiesis. However, their function in embryonic hematopoiesis still needs to be further discussed. In order to reveal the role of microRNA in embryonic hematopoiesis in mammals, the embryoid induced by mouse embryonic stem cells was used as a model of embryonic development. In the first step, on the basis of the accumulation of data in previous experiments, the candidate microRNA. with specific expression in embryonic hematogenesis was preliminarily determined. Secondly, in order to verify whether these candidate microRNA can regulate embryonic hematogenesis, we first constructed retrovirus vector and overexpressed candidate microRNA. in mouse embryonic stem cells by retrovirus. Thirdly, we constructed a mouse embryonic stem cell line which can overexpress candidate microRNA in conditional induction, which can induce high expression candidate microRNA, by tetracycline at a specific time of embryoid development. The changes of hematogenesis and embryonic development were detected by real-time fluorescence quantitative analysis and flow cytometry, and the possible regulatory factors and downstream target genes of candidate microRNA were obtained after the data were analyzed. This part of the work lays a foundation for the next step to study the pathway of action of these candidate microRNA and find out their direct sites of action. In addition, in order to facilitate the study of the role of microRNA and other exogenous genes in human embryonic stem cells, a conditional induced gene expression human embryonic stem cell line was constructed. By homologous recombination in the 3'UTR region of Actb gene, tetracycline regulated promoter, hygromycin (Hygromycine) resistance gene and site-directed recombinant enzyme system element (LoxP, Frt) were introduced. After successful integration, the foreign gene can be further recombined into the foreign gene and the transferred foreign gene or microRNA. can be expressed under the induction of doxycycline derivative doxycycline. This cell line provides a useful tool for us to study the function of genes or microRNA in human embryonic stem cells.
【學位授予單位】：華東師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R3411

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