發(fā)布時間：2019-05-12 02:39

【摘要】：結核病(Tuberculosis,TB)在全球范圍內廣泛地引起人和動物發(fā)病甚至死亡,引發(fā)重大的經(jīng)濟損失。早期準確診斷和對活動性肺結核病人的及時治療,減少結核發(fā)病率及降低死亡率非常重要。在結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)感染者中,超過95%表現(xiàn)為潛伏性結核感染(latent tuberculosis infection, LTBI),若在HIV感染或自身免疫性疾病致使機體免疫力低下情況下,LTBI日后可發(fā)展成為活動性結核,成為主要的傳染源,因此TB感染及時檢測對于控制結核病至關重要。目前應用最為廣泛的診斷方法是結核菌素試驗(tuberculin skin test,TST),該診斷方法是一種以純化蛋白衍生物(PPD)或舊結核菌素(OT)為抗原進行皮下注射的診斷方法,其特異性較差,診斷結果假陽性率較高。因此迫切需要研究開發(fā)出特異性好、便于臨床應用的鑒定方法。近年來引人注目的是對于結核分枝桿菌特異性抗原診斷價值的研究進展,因為比較基因組學提供了大量特異性抗原信息,并發(fā)現(xiàn)了16個MTB特異性差異區(qū)域(RD)。因此本研究選取RD2區(qū)域中的5種蛋白進行原核融合表達與純化,對它們免疫特性進行了初步分析,并對其牛結核血清學診斷價值進行比較研究。 1.結核分枝桿菌RD2區(qū)五種抗原蛋白的原核表達、純化和鑒定 選取MTB RD2區(qū)5種蛋白Rv1981、Rv1983、Rv1985、Rv1986和Rv1988作為研究對象,利用PCR擴增了相應的編碼基因,經(jīng)克隆篩選和測序鑒定正確后,利用pEASY-E1、 pET-30a(+)及pET-32a(+)質粒構建原核表達質粒。鑒定正確的表達質粒轉化進原核表達菌BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導表達,SDS-PAGE結果顯示誘導后各目的蛋白均得到成功表達,對可溶形式表達的融合蛋白直接進行鎳柱親和層析純化,對以包涵體形式表達的融合蛋白在進行變復性后進行鎳柱親和層析純化。Western-blotting結果表明,在使用抗His單抗及兔抗TB多抗血清反應后都出現(xiàn)了特異性目的條帶,表明融合蛋白具有較高的免疫反應性。同時,對這幾種分子的深入研究提供了條件。 2.融合蛋白免疫原性分析及其牛結核診斷價值評價 取Rv1981、Rv1983、Rv1985、Rv1986四種融合蛋白分別皮下免疫C57BL/6小鼠,100μg/只,每次免疫間隔兩周,于二免二周后取脾臟淋巴細胞進行免疫學試驗。利用夾心ELISA試驗檢測四種蛋白作為刺激抗原活化淋巴細胞分泌IFN-y、IL-2和IL-4水平,結果顯示：Rv1985與Rv1983刺激細胞產(chǎn)生IFN-y的能力最強,Rv1981刺激細胞產(chǎn)生IL-4的能力最強,而產(chǎn)生IFN-y能力在所有蛋白中最弱。 為評價上述蛋白抗原在牛結核血清學診斷中的潛能,我們進行了刺激試驗：將Rv1981、 Rv1983、Rv1985、Rv1986四種融合蛋白純化產(chǎn)物作為包被抗原,通過間接ELISA方法檢測臨床采集牛血漿上清中特異性抗體,結果顯示陽性符合率分別為：Rv1981為22%(15/68)、Rv1983為35.3%(24/68)、Rv1985為36.7%(25/68)及Rv1986為32.4%(22/68)。四種蛋白中,Rv1985與Bovine PPD有較高的協(xié)同性,顯示該蛋白擁有較高診斷潛能。此后將上述四種融合蛋白純化產(chǎn)物作為刺激劑刺激奶牛外周血,IFN-y檢測試劑盒檢測其活化抗原特異性細胞產(chǎn)生IFN-y水平,檢測的陽性符合率分別為30%(6/20)、20%(4/20),50%(10/20)及35%(7/20),顯示在牛結核血清學檢測中,該四種蛋白具有一定應用潛能。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R378.911

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 吉清,何鳳田;包涵體復性的研究進展[J];國外醫(yī)學.臨床生物化學與檢驗學分冊;2004年06期

2 彭哲;朱朝敏;;結核分枝桿菌RD1區(qū)研究進展[J];重慶醫(yī)學;2011年01期

3 朱紅裕;李強;;外源蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達策略[J];過程工程學報;2006年01期

4 井申榮;鄒全明;洪愉;毛旭虎;;重組人IL-10融合蛋白的表達及其生物學活性測定[J];免疫學雜志;2006年04期

5 邱燕;孫九如;黃陽濱;黃智華;陳霖杰;劉勇;林躍鑫;;重組人IL-4大腸桿菌表達與純化[J];生物工程學報;2006年06期

6 楊曉儀,林鍵,吳文言;重組蛋白包涵體的復性研究[J];生命科學研究;2004年02期

7 ;英國研制出新的牛結核病診斷方法[J];中國動物保健;2007年12期

8 胡茂志,焦新安,潘志明,劉業(yè)兵,邵國青,劉秀梵;豬肺炎霉形體單克隆抗體的制備與鑒定[J];中國獸醫(yī)科技;2004年12期

9 張海峰;盛偉華;繆競誠;謝宇鋒;李麗娥;馬麗麗;莊文卓;楊吉成;;重組人IL-18在大腸桿菌中的表達及其抗腫瘤作用[J];中國免疫學雜志;2006年02期

10 蘭德松;;牛結核病診斷技術研究概況[J];中國畜牧獸醫(yī)文摘;2011年02期

，

本文編號：2475039