【摘要】：間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）是具有多項分化潛能的成體干細胞，能夠分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞和肌肉細胞譜系。干細胞的成骨分化是一個復雜、調(diào)控嚴格的過程，這個過程受一系列內(nèi)源性和各種環(huán)境因子以及信號通路的影響。對間充質(zhì)干細胞成骨分化機制的研究，有望為臨床上治療骨缺損、骨折及骨不連等病癥提供新方案。 在間充質(zhì)干細胞成骨分化早期，骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone MorphogenesisProteins， BMPs）發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。 BMPs屬于轉(zhuǎn)化生長因子（Transforming Growth Factor, TGF）β超家族成員，是一組具有類似結(jié)構(gòu)的高度保守的分泌型多功能蛋白，在細胞黏附、增殖、分化，骨骼發(fā)育和骨組織形成中發(fā)揮重要作用。目前發(fā)現(xiàn)人BMP家族至少存在15種成員，其中BMP2，BMP4，BMP6，BMP7和BMP9能有效地在體內(nèi)和體外誘導間充質(zhì)干細胞向成骨分化。BMP9是骨源性最強的BMP之一，同時也是目前了解得最少的BMP之一。 我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，用BMP9腺病毒（Ad-BMP9）感染MSCs后，收集細胞總RNA進行微陣列分析，有大約40個基因的表達發(fā)生明顯變化。其中，，生長激素（Growth Hormone，GH）的表達上調(diào)最為顯著。這提示生長激素參與了BMP9誘導的間充質(zhì)干細胞分化過程，并且可能在其中發(fā)揮重要作用。生長激素是由垂體分泌的一種蛋白質(zhì)激素，通過與GH受體結(jié)合，或與胰島素樣生長因子Ⅰ（Insulin-like Growth FactorⅠ，IGF-Ⅰ）相互作用，影響骨骼的發(fā)育和生長。為了揭示生長激素在BMP9誘導的間充質(zhì)干細胞成骨分化中扮演的角色，探討其中的分子機制，本研究首先構(gòu)建了GH過表達的質(zhì)粒，并包裝相應(yīng)的腺病毒，其次，在體外、器官培養(yǎng)和體內(nèi)三個層面上研究GH和BMP9對間充質(zhì)干細胞成骨分化的影響，最后通過染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）和小分子抑制劑的使用探索其中的調(diào)控機制。我們主要的研究內(nèi)容包括： ①從Thermo公司購買含有人GH基因片段的質(zhì)粒，酶切后將GH基因片段連接到腺病毒穿梭質(zhì)粒上。測序鑒定后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BJAdEasy細胞中進行重組，并篩選陽性克隆。PacⅠ酶切將重組子線性化、純化，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到HEK293細胞中進行包裝。將病毒命名為AdR-GH。 ②C3H10T1/2細胞購買自ATCC公司，是常用的MSC細胞株。免疫熒光檢測C3H10T1/2間充質(zhì)干細胞標志物的表達。結(jié)果顯示，C3H10T1/2表達MSC標志物CD29/Integrinβ1，CD44，CD73， CD90/Thy-1，CD117/c-kit，BMPRⅡ，CD133/Prom1， CD105/Endoglin和CD166/ALCAM。 ③利用Ad-BMP9感染C3H10T1/2細胞，分別于感染后1、3、5、7天收集細胞總RNA，RT-PCR檢測GH的表達。結(jié)果顯示這4個時間點GH的表達均顯著增強。免疫組織化學染色(Immunohistochemistry，IHC)結(jié)果表明，GH在發(fā)育中長骨生長板的成骨細胞和軟骨細胞中表達。體外實驗設(shè)置4個組：Ad-GFP/Ad-RFP（對照組），Ad-GFP/AdR-GH，Ad-BMP9/Ad-RFP，Ad-BMP9/AdR-GH，用這4組病毒分別刺激MSCs，并檢測成骨細胞分化標記物的表達。這些標志物包括堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP），骨鈣素，骨橋蛋白和基質(zhì)的礦化作用(茜素紅染色)。結(jié)果表明，GH本身不能啟動MSCs的成骨分化，而當GH和BMP9共同作用時，成骨分化標志物的表達明顯強于其他3組，說明GH在體外能促進BMP9介導的MSCs成骨分化。 ④在器官培養(yǎng)的實驗中，我們截取胚胎期E18.5天的小鼠后肢進行培養(yǎng)，并利用上述4組病毒感染組織。將鈣黃綠素作為熒光指示劑加入培養(yǎng)基中追蹤骨發(fā)育過程，在病毒感染后2、4、8、12天測量記錄脛骨橫截面熒光面積。結(jié)果顯示，與對照組相比，單獨的BMP9能有效促進骨生成，但BMP9和GH組合的促進效果更為顯著。蘇木精-伊紅（Haematoxylin and eosin，HE）染色結(jié)果顯示，Ad-BMP9/AdR-GH組中肥大軟骨區(qū)域大于對照組。這些結(jié)果表明，GH能促進BMP9介導的軟骨內(nèi)成骨。 ⑤利用上述4組病毒感染C3H10T1/2細胞36小時后，收集細胞注射到無胸腺裸鼠皮下。注射4周后，處死裸鼠，收集移植部位進行微型計算機斷層掃描（Microcomputed Tomography，MicroCT）。通過Amira5.3軟件將掃描結(jié)果進行三維重建并進行統(tǒng)計分析。僅感染Ad-BMP9/Ad-RFP或Ad-BMP9/AdR-GH病毒的MSCs能生成異位骨，且BMP9和GH共同誘導的MSCs形成的異位骨骨量更多，骨密度更大。HE染色以及骨鈣素、骨橋蛋白的免疫組織化學染色結(jié)果顯示，BMP9誘導生成的異位骨中形成部分成熟的骨基質(zhì)和骨小梁，同時可觀察到未分化的間充質(zhì)祖細胞。而由BMP9和GH共同誘導生成的異位骨中存在更多的成熟骨基質(zhì)和更大，更厚的骨小梁，未分化的間充質(zhì)祖細胞相對較少。Masson’sTrichrome染色結(jié)果顯示， GH增強了BMP9誘導的基質(zhì)礦化作用。 ⑥在GH啟動子區(qū)域?qū)ふ壹俣ǖ腟mad結(jié)合位點，據(jù)此設(shè)計兩對PCR寡核苷酸序列用于ChIP分析。亞融合的C3H10T1/2細胞被AdGFP或AdBMP9感染30個小時。交聯(lián)細胞，超聲破碎基因組DNA，然后用抗Smad1/5/8抗體進行免疫共沉淀。分別用兩對引物與獲得的基因組DNA進行PCR反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗-Smad1/5/8抗體能拖下含有GH啟動子區(qū)域的基因組片段。表明GH是MSCs中BMP9誘導的Smad信號的一個下游靶點。在BMP9或BMP9/GH誘導培養(yǎng)的MSCs中分別加入STAT3、STAT5、JAK的小分子抑制劑后，于第5、7天檢測ALP活性。結(jié)果表明，這幾種抑制劑均能有效地抑制BMP9介導的ALP活性，同時，BMP9和GH協(xié)同誘導的ALP活性也受到明顯抑制。此外，RT-PCR結(jié)果顯示，GH能誘導IGF1的表達，并且GH誘導的IGF1表達能被JAK和STAT5抑制劑抑制。 綜合以上研究結(jié)果，我們認為生長激素與BMP9存在協(xié)同作用，通過激活JAK/STAT/IGF1信號通路促進間充質(zhì)干細胞的成骨分化。
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【學位授予單位】：重慶大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R329

【參考文獻】

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本文編號：2469828