【摘要】：2008年蔡晨冷等人利用Cre-LoxP遺傳示蹤發(fā)系統(tǒng)現(xiàn),小鼠心外膜組織中存在一種新的心臟祖細(xì)胞-Tbx18陽(yáng)性心外膜祖細(xì)胞,這種心臟祖細(xì)胞不斷遷移分化為心系細(xì)胞并對(duì)心臟室間隔、心房、心室肌、心瓣膜及冠狀動(dòng)脈的形成具有重要貢獻(xiàn)。因而,Tbx18陽(yáng)性心外膜祖細(xì)胞有可能成為心臟祖細(xì)胞新的來(lái)源。學(xué)者們發(fā)現(xiàn),在成年斑馬魚及小鼠心臟損傷處存在心外膜胚胎基因Tbx18的重新激活并通過(guò)血管生成作用參與了心臟的損傷修復(fù)反應(yīng),提示Tbx18陽(yáng)性心外膜祖細(xì)胞可能是心臟損傷修復(fù)的潛在的種子細(xì)胞。由此可見,深入、全面的研究胚胎時(shí)期Tbx18陽(yáng)性心外膜祖細(xì)胞遷移分化為心系細(xì)胞的機(jī)制對(duì)理解成年心臟損傷修復(fù)機(jī)制有重要啟發(fā)意義。 上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指在機(jī)體正常發(fā)育過(guò)程中以及目前已知的各種生理、病理?xiàng)l件刺激作用下,上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能均會(huì)發(fā)生向間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的現(xiàn)象：即細(xì)胞從具有緊密連接、極性和缺乏動(dòng)力的上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化為細(xì)胞間作用松散、無(wú)極性、活動(dòng)力強(qiáng)和能產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的間質(zhì)細(xì)胞。這個(gè)過(guò)程與胚胎發(fā)育、器官形成、疾病和腫瘤侵襲密切相關(guān)。已有研究表明,雞及小鼠胚胎心臟發(fā)育過(guò)程中,心外膜祖細(xì)胞經(jīng)歷EMT事件并能分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞,冠狀動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞及心臟成纖維細(xì)胞。存在于小鼠心外膜上皮中的Tbx118陽(yáng)性心外膜祖細(xì)胞也有可能是通過(guò)EMT事件向心系細(xì)胞分化。 本研究首先建立和鑒定Tbx18基因敲除小鼠模型和遺傳示蹤小鼠模型。為驗(yàn)證上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是Tbx18陽(yáng)性心外膜祖細(xì)胞向心系細(xì)胞分化的機(jī)制。我們利用Tbx18:Cre/R26RlacZ和Tbx18:Cre/R26REYFP這兩種Tbx18基因遺傳示蹤小鼠模型驗(yàn)證EMT事件參與了Tax18陽(yáng)性心外膜祖細(xì)胞向心系細(xì)胞分化。同時(shí)利用Tbx18基因敲除小鼠模型驗(yàn)證Tbx18基因敲除小鼠心臟表型和受損上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系。最后利用Tbx18基因敲除小鼠模型和遺傳示蹤小鼠模型深入探討EMT主要標(biāo)志物Snail1, Smad, Slug, Twist和E-cadherin作為局部信號(hào)在Tbx18陽(yáng)性心外膜祖細(xì)胞向心系細(xì)胞分化中的作用。 第一部分Tbx18基因敲除小鼠模型和遺傳示蹤小鼠模型的建立及鑒定 目的：探討建立及鑒定Tbx18基因敲除小鼠模型和遺傳示蹤小鼠模型的方法,為后續(xù)研究Tbx18陽(yáng)性心外膜祖細(xì)胞向心系細(xì)胞分化的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 方法：將引進(jìn)的Tbx18-Cre基因敲入雜合子小鼠進(jìn)行繁殖,并用PCR法鑒定其子代基因型。將子代雌雄雜合子小鼠互交,得到的Tbx18基因敲除、雜合子和野生型胚鼠,并用PCR.熒光定量PCR及胚胎大體形態(tài)鑒定出胚鼠基因型。將雜合子小鼠與RosaEYFP和Rosa26RLcz報(bào)告小鼠交配,得到Tbx18:Cre/Rosa26REYFP和Tbx18:Cre/Rosa26RLacz雙轉(zhuǎn)基因胚鼠,心臟行冰凍切片進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。 結(jié)果：成功繁殖并鑒定了一定數(shù)量的Tbx18-Cre基因敲入雜合子小鼠。利用Tbx18-Cre基因敲入雜合子小鼠和報(bào)告小鼠成功建立了Tbx18基因敲除小鼠模型和遺傳示蹤小鼠模型。PCR、熒光定量PCR及胚胎大體形態(tài)觀察結(jié)論一致性的檢測(cè)出基因敲除胚胎。PCR及免疫熒光檢測(cè)成功鑒定出Tbx18:Cre/Rosa26REYFP和Tbx18:Cre/Rosa26RLacz雙轉(zhuǎn)基因胚鼠。 結(jié)論：成功建立了Tbx18基因敲除小鼠模型和遺傳示蹤小鼠模型。用于繁殖、基因敲除及基因遺傳示蹤的子代基因型鑒定結(jié)果均符合孟德爾遺傳規(guī)律。PCR技術(shù)鑒定小鼠子代基因型具有廉價(jià)、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。 第二部分上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是Tbx18陽(yáng)性心外膜祖細(xì)胞向心系細(xì)胞分化的重要機(jī)制 目的：探討Tbx18陽(yáng)性心外膜祖細(xì)胞向心系細(xì)胞分化的可能機(jī)制。 方法：1)觀察Tbx18:Cre/Rosa26REYFP和Tbx18:Cre/Rosa26RLacz不同發(fā)育階段胚鼠Tbx18陽(yáng)性心外膜祖細(xì)胞遷移分化過(guò)程。2)通過(guò)Tbx18基因敲除模型觀察Tbx18基因敲除小鼠心臟表型和受損上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系 結(jié)果:1)在E11.5天,Tbx18陽(yáng)性心外膜祖細(xì)胞覆蓋在心臟表面,E13.5天及E16.5天可見Tbx18陽(yáng)性心外膜上皮細(xì)胞向心外膜下遷移形成間充質(zhì)細(xì)胞,即經(jīng)歷了上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。這些間充質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成了左右心室壁、心房,室間隔,冠狀動(dòng)脈血管平滑肌。2)E16.5天基因敲除心臟和野生型相比,四個(gè)腔室、瓣膜及右室壁未見異常,左室游離壁及室間隔室壁發(fā)育中等變薄,竇房結(jié)頭部缺失。與之相對(duì)應(yīng)的是,E16.5天基因敲除心臟心系細(xì)胞標(biāo)志物(除cTnT外)及間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物vimentin顯著減少。Vimentin顯著減少的部位在室間隔。 緒論:bx18陽(yáng)性心外膜祖細(xì)胞經(jīng)歷上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化后向心系細(xì)胞分化,Tbxl8基因敲除小鼠心臟表型和受損上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化存在密切關(guān)系。因此上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是Tbxl8陽(yáng)性心外膜祖細(xì)胞向心系細(xì)胞分化的重要機(jī)制。 第三部分上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化主要標(biāo)志物在Tbx18陽(yáng)性心外膜祖細(xì)胞向心系細(xì)胞分化過(guò)程中的作用 目的：上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化主要標(biāo)志物Snail1, Smad, Slug, Twist和E-cadherin在Tbxl8陽(yáng)性心外膜祖細(xì)胞向心系細(xì)胞分化中的作用。 方法：利用免疫熒光、Western blot及熒光定量PCR技術(shù)比較Tbxl8基因敲除小鼠和野生小鼠上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化主要標(biāo)志物Snail1, Smad, Slug, Twist和E-cadherin的表達(dá)差異；利用激光共聚焦技術(shù)和流式細(xì)胞分選術(shù)觀察Tbxl8:Cre/Rosa26REYFP不同時(shí)期胚胎心臟Tbxl8譜系細(xì)胞(包括心外膜祖細(xì)胞及其后代細(xì)胞)內(nèi)這些上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化主要標(biāo)志物的時(shí)空表達(dá)規(guī)律。 結(jié)果：1)和野生型小鼠相比,Tbxl8基因敲除小鼠心臟Snail1, Smad,Slug, Twist在mRNA和蛋白水平表達(dá)均顯著下調(diào),E-cadherin顯著上調(diào)。2)E16.5天心臟Tbx18譜系細(xì)胞和上述上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化主要標(biāo)志物在室間隔,心瓣膜,冠狀動(dòng)脈血管平滑肌部位發(fā)生共聚焦。這些標(biāo)志物和Tbx18基因在E12.5天至出生后第一天心臟內(nèi)表達(dá)水平呈現(xiàn)拋物線表達(dá)模式。 結(jié)論：上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化主要標(biāo)志物Snail1, Smad, Slug, Twist、 E-cadherin作為局部信號(hào)促進(jìn)了Tbx18陽(yáng)性心外膜祖細(xì)胞向心系細(xì)胞分化。
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【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 高翔;;小鼠基因功能研究及疾病模型系列專題(二)——基因工程小鼠的品系管理及基因型鑒定[J];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào);2010年02期

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本文編號(hào)：2467898