【摘要】：目的：(1)探討C02激光打標(biāo)機(jī)處理的有序排列微模板培養(yǎng)兔角膜基質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)特征及其細(xì)胞生物學(xué)變化。(2)探索角膜上皮、口腔黏膜上皮細(xì)胞在UpCellTM溫敏型表面培養(yǎng)皿上的合適接種密度及生長(zhǎng)特性,利用溫敏特性獲得無(wú)載體細(xì)胞片以及構(gòu)建口腔黏膜上皮細(xì)胞片的意義。(3)探討重組Maxadilan(MAX)對(duì)角膜基質(zhì)微環(huán)境下培養(yǎng)的口腔黏膜上皮細(xì)胞的CK3表達(dá)的影響；不同濃度的MAX對(duì)角膜基質(zhì)細(xì)胞的影響。 方法：(1)用CO2激光打標(biāo)機(jī)刻制的聚苯乙烯有序排列微模板培養(yǎng)兔角膜基質(zhì)細(xì)胞,模板溝槽劃線間隔距離0.25mmm者為窄間隔組,間隔距離1mm者為寬間隔組,平板組作為對(duì)照組。將角膜基質(zhì)細(xì)胞懸液1×105/ml細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)板,倒置顯微鏡下每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況、HE染色觀察細(xì)胞排列的形態(tài)學(xué)差異、免疫熒光法檢測(cè)培養(yǎng)板上細(xì)胞的波形蛋白、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)顯微鏡下觀察24h窄間隔組細(xì)胞的接觸指引特性及細(xì)胞的動(dòng)態(tài)生長(zhǎng)過(guò)程。(2) UpCellTM溫敏型表面培養(yǎng)皿及普通培養(yǎng)皿上接種不同密度的原代兔角膜上皮、口腔黏膜上皮細(xì)胞,置于37℃,5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。通過(guò)倒置顯微鏡觀察兩種細(xì)胞在溫敏培養(yǎng)皿上生長(zhǎng)狀況、形態(tài)學(xué)差異,同時(shí)尋求合適的接種密度；吖啶橙染色顯示即將獲取細(xì)胞片的活性；獲取細(xì)胞片后石蠟切片HE染色以及掃描電鏡觀察細(xì)胞片的結(jié)構(gòu)。(3)用RT-PCR檢測(cè)PAC1受體在角膜基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)情況；Western-Blot檢測(cè)PACl受體在角膜上皮細(xì)胞、角膜基質(zhì)細(xì)胞及口腔粘膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)檢測(cè)；采用普通培養(yǎng)法及24h饑餓法分別添加不同濃度的MAX,培養(yǎng)兔角膜基質(zhì)細(xì)胞,運(yùn)用CCK8檢測(cè)MAX對(duì)角膜基質(zhì)細(xì)胞的促增殖作用；用免疫熒光定量Real-TimePCR檢測(cè)以下4組細(xì)胞角蛋白CK3的表達(dá)差異：第一組,口腔黏膜上皮細(xì)胞+角膜基質(zhì)細(xì)胞(通過(guò)插入式培養(yǎng)皿)。第二組,口腔黏膜上皮細(xì)胞+角膜基質(zhì)細(xì)胞+100nM MAX。第三組,單純口腔黏膜上皮細(xì)胞。第四組,單純角膜上皮細(xì)胞。 結(jié)果：(1)培養(yǎng)第1天倒置顯微鏡下見角膜基質(zhì)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),窄間隔組和寬間隔組細(xì)胞逐漸圍繞溝槽接觸指引生長(zhǎng),表現(xiàn)為有序排列,且窄間隔組較寬間隔組明顯。HE染色與免疫熒光染色顯示培養(yǎng)細(xì)胞在窄間隔組溝槽的接觸指引下呈有序排列,呈現(xiàn)10余層細(xì)胞排列的平行板層結(jié)構(gòu)。3組細(xì)胞波形蛋白免疫熒光染色均呈陽(yáng)性反應(yīng)。實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)顯微鏡下可見窄寬間隔組細(xì)胞體部首先貼壁,在接觸指引下生長(zhǎng),而細(xì)胞在干燥環(huán)境下的凋亡始于細(xì)胞偽足突起處。(2)不同密度接種于UpCellTM溫敏型表面培養(yǎng)皿及普通培養(yǎng)皿中的原代兔角膜上皮、口腔黏膜上皮細(xì)胞,早期沒(méi)有表現(xiàn)出形態(tài)學(xué)上的差別,且在溫敏型表面培養(yǎng)皿及普通培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)狀況一致。隨時(shí)間延長(zhǎng)5×104/ml密度細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,2×105/ml密度的細(xì)胞容易出現(xiàn)凋亡態(tài),1×105/ml密度接種細(xì)胞出現(xiàn)鋪路石狀細(xì)胞,有較多細(xì)胞克隆中心形成,細(xì)胞呈復(fù)層,8天后生長(zhǎng)狀態(tài)最佳。20℃-25℃低溫培養(yǎng)后見培養(yǎng)皿的局部有細(xì)胞片脫離溫敏材料的表面,呈卷曲狀,隨時(shí)間延長(zhǎng)發(fā)現(xiàn)脫離的細(xì)胞片越來(lái)越大,石蠟切片HE染色細(xì)胞呈復(fù)層,掃描電鏡觀察細(xì)胞片細(xì)胞間交錯(cuò)連接明顯,排列緊密。(3)RT-PCR證實(shí)角膜基質(zhì)細(xì)胞上有PAC1受體的表達(dá),Western-Blot證實(shí)角膜上皮細(xì)胞、角膜基質(zhì)細(xì)胞及口腔黏膜上皮細(xì)胞上PAC1受體的表達(dá)陽(yáng)性；CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示MAX對(duì)角膜基質(zhì)細(xì)胞有促進(jìn)作用；Real-Time PCR證實(shí)MAX促進(jìn)與角膜基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的口腔黏膜上皮細(xì)胞的CK3表達(dá)。 結(jié)論：(1)利用CO2激光打標(biāo)機(jī)制備的有序排列微模板可獲得有序排列角膜基質(zhì)細(xì)胞,有利于在接近于生理狀態(tài)條件下角膜基質(zhì)層的構(gòu)建。(2)UpCellTM溫敏型表面培養(yǎng)皿獲取無(wú)載體細(xì)胞片,符合構(gòu)建生理狀態(tài)的角膜上皮層的要求。(3)角膜上皮細(xì)胞、角膜基質(zhì)細(xì)胞及口腔黏膜上皮細(xì)胞均表達(dá)]PAC1受體；PAC1受體激動(dòng)劑Maxadilan對(duì)角膜基質(zhì)細(xì)胞具有促增殖作用,并促進(jìn)口腔黏膜上皮細(xì)胞CK3的表達(dá),Maxadilan有利于組織工程角膜種子細(xì)胞的生長(zhǎng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R314

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4 劉s，

本文編號(hào)：2464176