【摘要】：百日咳是由百日咳鮑特氏菌引起的一種急性呼吸道傳染病,傳染性較強(qiáng),人群普遍易感,其中尤以嬰幼兒多見。盡管現(xiàn)在世界上絕大多數(shù)國(guó)家實(shí)施百日咳疫苗的免疫接種多年,但百日咳仍是目前疫苗可預(yù)防之疾病中死亡病例的主要原因之一。即便是在疫苗接種覆蓋率很高的發(fā)達(dá)國(guó)家,近年來百日咳發(fā)病率也有上升的趨勢(shì),值得特別注意的是,已接種疫苗的青少年和成人患百日咳的人數(shù)逐漸增多,但他們的癥狀并不典型,臨床上極易誤診,而且研究表明這些人往往是嬰幼兒百日咳的重要傳染源,因此,百日咳的研究越來越引起人們的重視。本課題通過研究建立檢測(cè)和鑒別百日咳鮑特氏菌的多重實(shí)時(shí)PCR方法;應(yīng)用多位點(diǎn)可變數(shù)量串聯(lián)重復(fù)序列分析(MLVA)和多位點(diǎn)序列分型(MLST)方法分析中國(guó)不同時(shí)期收集的百日咳鮑特氏菌分離菌株和疫苗株,了解在我國(guó)實(shí)施百日咳疫苗免疫接種半個(gè)世紀(jì)以來,流行菌株的基因特征;同時(shí)對(duì)我國(guó)無細(xì)胞百日咳疫苗株CS株和現(xiàn)在流行菌株進(jìn)行全基因組序列測(cè)定,在全基因組水平分析菌株之間的差異位點(diǎn),并以此為基礎(chǔ)分析不同來源和不同時(shí)期的菌株基因組的單核苷酸多態(tài)性(SNP)和插入或缺失(indel)位點(diǎn)的分布,探討細(xì)菌分子進(jìn)化機(jī)制。 多重實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)百日咳鮑特氏菌方法的研究 成功建立了檢測(cè)和鑒定百日咳鮑特氏菌多重實(shí)時(shí)PCR方法,在同一個(gè)反應(yīng)體系中,能同時(shí)擴(kuò)增3個(gè)靶基因,即百日咳鮑特氏菌的百日咳毒素基因啟動(dòng)子區(qū)域(ptxP)和插入序列(IS)481序列,副百日咳鮑特氏菌的IS1001序列。通過與針對(duì)各靶基因的單道實(shí)時(shí)PCR方法進(jìn)行平行檢測(cè)比較,顯示多重PCR系統(tǒng)中各種靶基因的靈敏度并沒有發(fā)生改變,即在一個(gè)反應(yīng)多重實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)中,檢測(cè)百日咳鮑特氏菌最低限為1-5 CFU,副百日咳鮑特氏菌為1 CFU。多重實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)中各種靶基因重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示批內(nèi)和批間變異系數(shù)均低于7%,表明建立的檢測(cè)方法具有良好的重復(fù)性。由于在多重PCR系統(tǒng)中設(shè)定了ptxP和IS481兩個(gè)靶基因在同一反應(yīng)體系中檢測(cè)分析百日咳鮑特氏菌,改善了方法的特異性,提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。應(yīng)用本研究建立的多重實(shí)時(shí)PCR方法檢測(cè)分析以前分離保存的百日咳鮑特氏菌DNA樣品,進(jìn)一步從分子水平確認(rèn)這些百日咳桿菌菌株,為下一步百日咳鮑特氏菌基因組多態(tài)性分析的研究對(duì)象提供技術(shù)保障。 中國(guó)百日咳鮑特氏菌分離菌株基因組多態(tài)性研究 本實(shí)驗(yàn)以百日咳鮑特氏菌中兩種重要的表面蛋白基因Prn和tcfA以及百日咳毒素基因的上游啟動(dòng)子區(qū)域(ptxP)為分子marker,對(duì)1950-2007年期間在中國(guó)分離的115株菌株和3株疫苗株基因組的多位點(diǎn)序列進(jìn)行分析,共發(fā)現(xiàn)12種MLST型,在不同時(shí)期分離菌株中,均以MLST-1/1/2型(Prn/ptxP/tcfA)為主,其中兩種疫苗株(CS和P3S10株)也屬于MLST-1/1/2型,而另一株疫苗株18530為MLST-1/2/2型。提示在中國(guó)目前主要流行菌株的MLST型與疫苗株相似。在中國(guó)2000年才發(fā)現(xiàn)MLST-2/3/2型菌株,且出現(xiàn)頻率較低(19.04%)。基于MLVA分析將115株百日咳鮑特氏菌菌株和3株疫苗株分成了46個(gè)不同的MLVA型,其中發(fā)現(xiàn)13種新的MLVA型菌株。在中國(guó)不同的時(shí)期流行著以不同MLVA型為主的菌株;主要流行MLVA型為MLVA-N1、95和33型。與未實(shí)施疫苗免疫接種或免疫接種初期的菌株相比較,MLVA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在中國(guó)免疫接種百日咳疫苗50多年后,菌株基因多態(tài)性并沒有發(fā)生顯著性的改變。這些分析結(jié)果證實(shí)在中國(guó)當(dāng)前流行的百日咳鮑特氏菌菌株與其他實(shí)施疫苗免疫接種多年和免疫接種覆蓋率高的歐洲國(guó)家不同。此外,通過比較MLVA、MLST和PFGE三種分型方法的多態(tài)性指數(shù),統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明MLVA分型方法具有最好的分辨率。通過對(duì)中國(guó)不同時(shí)期百日咳桿菌菌株的MLVA和MLST分析,掌握了我國(guó)百日咳分子流行病學(xué)的第一手資料,對(duì)我國(guó)有效預(yù)防和控制百日咳的流行以及制定新的百日咳疫苗免疫策略具有指導(dǎo)意義。 無細(xì)胞百日咳疫苗株CS的全基因組序列測(cè)定及分析 聯(lián)合應(yīng)用焦磷酸和Sanger測(cè)序技術(shù)方法對(duì)我國(guó)無細(xì)胞百日咳疫苗生產(chǎn)株CS進(jìn)行全基因組序列測(cè)定,結(jié)果顯示該菌株基因組由一條環(huán)形染色體組成,其長(zhǎng)度為4,124,236 bp,G+C含量為67.73%,編碼基因(CDS)為3,456個(gè),假基因數(shù)量357個(gè),平均基因大小為982 bp,編碼產(chǎn)物大約含有327個(gè)氨基酸。與已發(fā)表的日本分離菌株Tohama I比較基因組學(xué)分析結(jié)果表明,CS菌株的全基因組序列較Tohama I(4,086,189 bp)大38,047 bp,在CS全基因組中含有兩個(gè)特有基因島,即基因島CS-1(22,578 bp)和基因島CS-2(16,690 bp),兩株細(xì)菌的CDS同源性高達(dá)99.53%。我們校正了Tohama I菌株全基因組序列中存在25個(gè)SNP和10個(gè)indel位點(diǎn)測(cè)序錯(cuò)誤,CS與Tohama I菌株基因組之間存在301個(gè)SNP和40個(gè)較小的indel�；谶@些比較基因組學(xué)分析結(jié)果,估算了百日咳鮑特氏菌基因組的SNP豐度為每13,701個(gè)堿基含有1個(gè)SNP,表明百日咳鮑特氏菌為最保守的單形細(xì)菌之一。將兩株細(xì)菌基因組中插入序列和假基因的數(shù)量及其分布的對(duì)比分析,進(jìn)一步證實(shí)插入序列在假基因形成以及維持細(xì)菌基因組多態(tài)性的作用。與其他鮑特氏菌屬中已完成全基因組測(cè)序的支氣管炎鮑特氏菌、副百日咳鮑特氏菌、Bordetella avium和Bordetella petri的比較基因組學(xué)分析,鑒定出五種細(xì)菌(共6株菌株)全基因組中具有同源性的核心基因1,785個(gè),通過對(duì)鮑特氏菌屬的核心基因中進(jìn)行PAML分析,結(jié)果顯示僅有不到1%的基因的可能受到正選擇的影響,表明正選擇可能對(duì)百日咳分子進(jìn)化影響較少。這些資料對(duì)于進(jìn)一步研究百日咳鮑特氏菌及其他鮑特氏菌的分子進(jìn)化奠定基礎(chǔ)。 百日咳鮑特氏菌的微進(jìn)化研究 通過檢測(cè)分析CS和Tohama I菌株之間差異位點(diǎn)在七株不同時(shí)期分離于中國(guó)和日本菌株中的分布,發(fā)現(xiàn)新的131個(gè)SNP和8個(gè)indel。以支氣管炎鮑特氏菌中SNP位點(diǎn)堿基為參考,對(duì)比分析百日咳桿菌菌株SNP位點(diǎn)發(fā)生突變的堿基,發(fā)現(xiàn)在百日咳鮑特氏菌基因組中SNP的突變具有GC堿基偏見性。通過SNP的相容性矩陣模型分析表明在百日咳鮑特氏菌核心基因內(nèi)不相容性低,泛基因中不相容性相對(duì)較高,提示在泛基因中,可能受到重組或重復(fù)突變導(dǎo)致核苷酸位點(diǎn)發(fā)生變化,從而在細(xì)菌適應(yīng)中發(fā)揮重要作用,這也可能是百日咳鮑特氏菌一種重要的分子進(jìn)化機(jī)制。BP284的重測(cè)序分析結(jié)果顯示,目前在中國(guó)流行菌株基因組中并沒有獲得新的基因,可能以積累SNP的改變?cè)诩?xì)菌適應(yīng)性進(jìn)化過程中起重要作用。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示現(xiàn)階段中國(guó)的流行菌株與上世紀(jì)50年代分離菌株有較大的進(jìn)化距離,位于兩個(gè)疫苗菌株的外部,其基因組上的改變不僅僅是疫苗壓力造成的適應(yīng)進(jìn)化,而是進(jìn)化分支上的根本改變。詳細(xì)分析各菌株基因組中indel事件,建議indel與菌株來源存在有一定相關(guān)性的,并發(fā)現(xiàn)各菌株發(fā)生indel事件分布與基于SNP分析系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析結(jié)果相一致。這些結(jié)果有利于我們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)百日咳鮑特氏菌全基因組水平上的微進(jìn)化,同時(shí)也為改進(jìn)百日咳疫苗提供了新的思路。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R378

【參考文獻(xiàn)】

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1 侯啟明,馬霄,張庶民,趙建榮,梁雅文,駱鵬,呂慧賢,張路民,顧磊,田霖,雷殿良,朱玲,趙雷,唐海文;三組分的無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗安全性和免疫原性研究[J];中國(guó)計(jì)劃免疫;2003年05期

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本文編號(hào)：2463810