發(fā)布時間：2019-04-19 06:13

【摘要】：目的構建體外定向誘導的小鼠血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)向成骨樣細胞分化的細胞模型,為本系列研究奠定基礎。 方法VSMC使用含10mMβ-甘油磷酸鈉(P-glycerophosphate disodium, β-GP)的培養(yǎng)基培養(yǎng),定向誘導原代小鼠VSMC分化為成骨樣細胞,在細胞培養(yǎng)的0天、12天分別提取總RNA做逆轉錄,熒光實時定量PCR檢測Runt相關轉錄因子2(Runt-related transcription factor2, Runx2)、骨鈣素(osteocalcin, OC)、骨橋蛋白(osteopontin, OPN) mRNA的表達水平；檢測堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性；進行礦化結節(jié)染色。分別在細胞培養(yǎng)的0天、3天、8天、12天提取總蛋白做Western Blot,觀察平滑肌細胞標志物平滑肌肌動蛋白a (smooth muscle alpha-actin, SMα-actin)及Runx2蛋白的表達情況。 結果VSMC經(jīng)過12天誘導后,β-GP可增強Runx2、OC、OPN mRNA的表達,提高ALP活性,促進礦化結節(jié)的形成,增強Runx2蛋白的表達,并抑制SMa-actin蛋白的表達。 結論本研究成功構建了小鼠VSMC成骨樣分化的細胞模型。β-GP增強成骨細胞表型基因Runx2、OC、OPN mRNA表達；增強Runx2蛋白表達；抑制平滑肌細胞表型標志物SMa-actin蛋白表達。β-GP的誘導作用具有時間依賴性特征。 目的檢測VSMC成骨樣分化前后以及5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-dC)干預后Runx2基因啟動子的甲基化狀態(tài),觀察5-Aza-dC對VSMC成骨樣分化過程中Runx2表達的影響,探討Runx2甲基化狀態(tài)影響VSMC成骨樣分化過程的機制。 方法提取對照組VSMC的DNA,通過亞硫酸氫鈉測序,確定Runx2基因啟動子的甲基化狀態(tài)。用MTT法檢測5-Aza-dC對VSMC增殖的影響,獲得適宜的干預濃度。將小鼠VSMC暴露于含有不同濃度的5-Aza-dC礦化培養(yǎng)基中培養(yǎng)12天,分別抽提VSMC的總RNA和總蛋白,觀察Runx2在mRNA及蛋白水平的表達情況；用含相同濃度5-Aza-dC(15μM)的礦化培養(yǎng)基干預VSMC,在細胞培養(yǎng)的0天、3天、8天和12天分別抽提總RNA做逆轉錄,熒光實時定量PCR觀察Runx2mRNA表達情況,Western Blot觀察Runx2在蛋白水平的表達。 分別提取10mM β-GP誘導12天及15μM5-Aza-dC聯(lián)合10mM P-GP干預12天VSMC的DNA,通過亞硫酸氫鈉測序,確定Runx2基因啟動子的甲基化狀態(tài)。 結果對照組VSMC的Runx2基因啟動子呈高甲基化狀態(tài)。20μM5-Aza-dC干預VSMC24小時后,細胞密度較對照組顯著降低(P0.05)。低于20μM的5-Aza-dC(5,10,15μM)是適宜的干預濃度并用于后續(xù)的研究o5-Aza-dC上調(diào)VSMC的Runx2表達,且對Runx2表達的影響呈劑量和時間依賴效應,5-Aza-dC干預的最佳濃度為15μM。 亞硫酸氫鈉測序結果顯示,10mM β-GP誘導12天后,Runx2基因啟動子甲基化水平較對照組明顯降低；15μM5-Aza-dC聯(lián)合10mM β-GP干預12天后,Runx2基因啟動子甲基化水平較誘導組和對照組均顯著降低。 結論VSMC向成骨樣細胞分化后,Runx2基因啟動子甲基化水平降低；5-Aza-dC干預后,Runx2基因啟動子甲基化水平進一步降低。5-Aza-dC通過降低Runx2基因啟動子甲基化水平,上調(diào)Runx2的表達,呈現(xiàn)劑量和時間依賴效應。Runx2基因啟動子去甲基化可能促進VSMC成骨樣分化。 目的vaspin(visceral adipose tissue-derived serpin)是一種新近發(fā)現(xiàn)的由內(nèi)臟脂肪組織分泌的脂肪因子,具有增強胰島素敏感性的作用。近期的研究發(fā)現(xiàn)vaspin通過PI3-K/Akt信號轉導通路抑制血管內(nèi)皮細胞的凋亡。但vaspin的主要生理作用及相關機制仍不明確。本研究首次檢測vaspin對人成骨細胞(human osteoblast, hOB)凋亡的影響,并探討vaspin對hOB凋亡的作用機制。 方法用ELISA法和TUNEL法測定hOB凋亡情況。應用Western blot分析vaspin對hOB細胞Bcl-2及Bax蛋白表達的影響。應用Western blot檢測vaspin干預后p-ERK1/2, ERK1/2, p-JNK, JNK, p-p38, p38, p-Akt和Akt的表達。用ERK信號轉導阻斷劑PD98059干預,觀察vaspin對hOB凋亡的作用及信號轉導的影響。 結果(1)vaspin可抑制hOB凋亡。(2)vaspin促進Bcl-2蛋白表達,抑制Bax蛋白表達,均呈現(xiàn)劑量依賴效應。(3)vaspin干預可誘導ERK磷酸化,MAPK/ERK信號轉導阻斷劑PD98059能阻斷vaspin對ERK的活化作用；vaspin對p38、JNK和Akt磷酸化無影響。(4)PD98059能抑制vaspin對hOB凋亡的抑制作用。 結論vaspin通過MAPK/ERK信號轉導通路抑制hOB凋亡
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【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R329.2

【參考文獻】

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本文編號：2460672