發(fā)布時間：2019-04-09 13:40

【摘要】：【目的】 前期研究表明，人纖維介素（human fibrinogen like protein2prothrombinase,fgl2）是腫瘤生長和轉移等的關鍵因素，本研究針對這一基因，構建重組hfgl2的微小RNA（miRNA）腺病毒（Adenovirus，Ad）表達質(zhì)粒（pAd-hfgl2-miRNA），并進行包裝、擴增為重組hfgl2-miRNA腺病毒（Ad-hfgl2-miRNA）。研究重組Ad-hfgl2-miRNA在細胞水平對hfgl2基因表達的抑制作用，及其在裸小鼠皮下移植瘤肝癌模型中體內(nèi)hfgl2表達的分布情況。 【方法】 1.利用miRNA設計軟件，針對hfgl2基因分別設計3對pre-miRNA序列，構建表達質(zhì)粒， pcDNA6.2-hfgl2-miRNA1、2、3和非相關干擾質(zhì)粒，然后將其分別與pcDNA3.1-hfgl2共轉染至人胚腎細胞（293T細胞），通過Real-time PCR和western-blot檢測在細胞水平的干預效應。 2.參照Invitrogen公司的腺病毒表達系統(tǒng)試劑盒說明書，使用GATEWAY技術將pcDNA6.2-hfgl2-miRNA1表達質(zhì)粒重組成pAd-hfgl2-miRNA腺病毒表達質(zhì)粒。然后進行病毒包裝、擴增，制備重組hfg12-miRNA腺病毒顆粒。 3.使用病毒DNA小提試劑盒，PCR擴增片段，鑒定目的基因。 4.使用TCID50法測定重組Ad-hfgl2-miRNA的滴度。 5.確定腺病毒感染HCCLM6細胞的最適感染復數(shù)MOI，并共培養(yǎng)，使用Realtime PCR和Western-Blot檢測其抑制作用，使用PKH26法以流式細胞技術檢測hfgl2干擾后的HCCLM6細胞增殖能力的改變；使用CCK-8法測定半數(shù)抑制濃度。 6.瘤內(nèi)注射1×109IU帶有綠色熒光蛋白的重組Ad-hfgl2-miRNA，使用活體熒光成像儀連續(xù)拍照，直至熒光消失。 7.使用Realtime PCR檢測瘤內(nèi)注射1×10~9IU重組Ad-hfgl2-miRNA后第1、3、7、9、11、15、19、24天，裸小鼠人肝癌模型的心、肝、脾、肺、腎、小腸及荷瘤的hfgl2-miRNA表達情況。 8.采集瘤內(nèi)注射1×10~9IU重組Ad-irrelevant-miRNA后第1、3、7、11、24天裸小鼠人肝癌模型的眼球血，采集有荷瘤但未進行任何干預的裸小鼠的眼球血及無荷瘤的正常裸小鼠的眼球血，一并行谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH-L）、尿素氮（BUN）、血肌酐（CR）檢測。重組Ad-irrelevant-miRNA干預裸小鼠的心、肝組織用4％的甲醛固定，行H.E.染色，觀察組織病理學改變。 【結果】 1.成功構建重組人fg12微小RNA腺病毒表達載體，合成、擴增重組人fg12微小RNA腺病毒。 2.在細胞水平水平，重組Ad-hfgl2-miRNA對hfgl2表達具有明顯抑制作用，IC50=600MOI。 3.活體熒光成像儀可觀察到注射后第1天即有熒光表達，以第3、4天表達最強，第7、8天消失。 4. QRT-realtime PCR可在裸小鼠心、肝、脾、肺、腎、小腸及給藥部位荷瘤檢測到hfgl2-miRNA，并維持停藥后第24天。心、脾、肺、腎、荷瘤組織中的mRNA表達水平，以給藥后第7天為表達高峰，組間無明顯差異，P＞0.05。在肝臟中的mRNA水平，第3天為表達高峰，較空白對照組、其他時間點明顯增高，具有顯著性差異P＜0.05。在小腸中的mRNA水平，第7天為表達高峰，較空白對照組、其他時間點明顯增高，具有顯著性差異P＜0.01。第11天表達水平較空白對照組明顯增高，，兩者比較具有統(tǒng)計學意義P＜0.05，其他時間點與空白對照組無明顯差異。 5.血生化檢測：Ad-irrelevant-miRNA注射后，第1、3、7、11、24天，ALT、AST、CK、LDH-L可觀察到增高趨勢，但無統(tǒng)計學異常，P＞0.05。BUN、CR基本正常。非相關對照組、空白有荷瘤對照組與空白無荷瘤對照組之間無顯著性差異，P＞0.05。心、肝組織HE染色，顯微鏡下未見實質(zhì)細胞明顯損傷性改變（如：細胞大量壞死，明顯出血和炎癥細胞浸潤等）。 【結論】 1.重組人fg12微小RNA腺病毒表達載體的成功構建，為研究miRNA對基因治療提供應用基礎。 2.重組人fgl2微小RNA腺病毒注射液在體外可有效抑制hfgl2的表達及增殖作用，為肝癌模型體內(nèi)實驗提供實驗基礎。 3. hfgl2在模型中廣泛分布，重組人fgl2微小RNA腺病毒注射液在體內(nèi)無明顯毒性作用，為針對hfgl2這一關鍵靶基因的肝癌治療的安全性研究提供了基礎。
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【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R3416;R735.7

【參考文獻】

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1 吳濤;石寶晨;陳潤生;;RNA干涉現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)與研究進展——2006年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎簡介[J];生物化學與生物物理進展;2006年10期

本文編號：2455228