【摘要】：目的 檢測心肌微環(huán)境下,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)向心肌細(xì)胞(CM)轉(zhuǎn)分化過程中組蛋白去乙�；�1(HDAC1)的時(shí)相表達(dá),初步探討成體干細(xì)胞定向轉(zhuǎn)分化的乙�；{(diào)控機(jī)制。 方法 1.采用全骨髓貼壁法體外分離、培養(yǎng)、純化SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs),當(dāng)細(xì)胞達(dá)80-90%融合時(shí),用胰酶-EDTA(0.25%:0.05%)消化細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取第3代細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞表面標(biāo)記檢測,并誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞分化。茜素紅染色鑒定BMSCs成骨分化的能力,油紅O染色鑒定BMSCs成脂肪分化的能力。 2. 293A細(xì)胞培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞達(dá)50-70%融合時(shí),用0.25%胰酶消化細(xì)胞,以1:10-1:20傳代擴(kuò)增培養(yǎng)。 3. Ad-EGFP以MOI 100轉(zhuǎn)染90-100%融合的293A細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增,轉(zhuǎn)染3天后,細(xì)胞出現(xiàn)病變效應(yīng),收集細(xì)胞。 4. Ad-EGFP以MOI 0、10、50、100、200、400轉(zhuǎn)染BMSCs,流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率,并得出最佳轉(zhuǎn)染效率的MOI值。 5.新生乳鼠心肌細(xì)胞(cardiomyocytes,CM)分離、培養(yǎng),72 h后免疫熒光染色法鑒定心肌肌鈣蛋白T(CTnT)的表達(dá)情況。 6.將Ad-EGFP轉(zhuǎn)染后的BMSCs與CM以1:1比例直接接觸共培養(yǎng)。 7.依據(jù)共培養(yǎng)的時(shí)間,將實(shí)驗(yàn)分為六組,即BMSCs組(空白對照組)、共培養(yǎng)3天、6天、9天、12天組、心肌細(xì)胞(CM)組,收集細(xì)胞(1×107),流式細(xì)胞儀488 nm波長分選EGFP+BMSCs。 8.免疫熒光染色法檢測EGFP+BMSCs中心臟肌鈣蛋白T(CTnT)的表達(dá)。 9. FQ-PCR檢測組蛋白去乙�；�1(histone deacetylase 1,HDAC1)的mRNA表達(dá)。 10. Western Blot檢測組蛋白去乙�；�1(HDAC1)的蛋白表達(dá)。 11.數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x±s)表示,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組之間比較采用單因素方差分析,P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1.原代及傳代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞均呈成纖維細(xì)胞樣的長梭形,第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不表達(dá)造血標(biāo)志CD34(3.04%)、CD45(1.14%) ,強(qiáng)表達(dá)CD29 (99.86%)、CD44 (99.28%)、CD90(99.74%)等基質(zhì)細(xì)胞/間質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志。成骨誘導(dǎo)21 d后,可見大量橘紅色礦化結(jié)節(jié)形成。成脂誘導(dǎo)2-3周后,可見細(xì)胞的胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量紅染脂滴。 2. 293A細(xì)胞貼壁后呈成纖維細(xì)胞樣,Ad-EGFP轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞第3天,細(xì)胞變圓、脫落,呈葡萄串樣聚集,熒光顯微鏡下觀察,293A細(xì)胞發(fā)出綠色熒光。 3. EGFP在Ad-EGFP轉(zhuǎn)染BMSCs 24 h后開始表達(dá),72 h后達(dá)到峰值。MOI 10-100時(shí),轉(zhuǎn)染效率不足60%;MOI 400時(shí),轉(zhuǎn)染效率達(dá)80-85%,但BMSCs出現(xiàn)細(xì)胞病理效應(yīng)(CPE);MOI 200時(shí),細(xì)胞無明顯形態(tài)改變,轉(zhuǎn)染效率近80%。 4.心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)24 h后出現(xiàn)自主收縮,呈三角形或扁平不規(guī)則形,72 h后,免疫熒光染色提示心臟肌鈣蛋白T(CTnT)陽性率達(dá)90%以上。 5. BMSCs與CM共培養(yǎng)2-3天后,可見與CM直接接觸的長梭形BMSCs逐漸縮短、增粗,4-5天后熒光顯微鏡下顯示部分EGFP+BMSCs表達(dá)CTnT,12天后終止共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),未見EGFP+BMSCs自發(fā)搏動。流式細(xì)胞術(shù)檢測分選的EGFP+BMSCs陽性率可達(dá)97%以上。 6. HDAC1 mRNA在各組標(biāo)本均有表達(dá),在共培養(yǎng)3天、6天、9天、12天4個(gè)時(shí)點(diǎn)組和CM組中的表達(dá)量均顯著低于對照(BMSCs)組,P0.05,BMSCs組中的HDAC1 mRNA的表達(dá)量約是CM組的14倍。 7.與對照組(BMSCs組)比較, HDAC1蛋白的表達(dá)水平在共培養(yǎng)3天、6天、 9天組有明顯降低(P0.05),BMSCs組中HDAC1蛋白的表達(dá)量約是CM組的8倍。 結(jié)論HDAC1負(fù)性調(diào)節(jié)微環(huán)境下BMSCs向心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。
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【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2448685