【摘要】：在瘧疾流行地區(qū),孕婦是感染瘧疾的高危人群。在撒哈拉以南非洲地區(qū),每年有二千五百萬孕婦受到瘧疾感染的威脅,妊娠相關瘧疾(Pregnancy associated malaria,PAM)已經(jīng)成為疫源地最為嚴重的公共衛(wèi)生安全問題。PAM會導致新生兒低體重(Low birth weight,LBW)、流產(chǎn)、母體貧血。在全球范圍內,這一系列嚴重的并發(fā)癥每年造成大約75,000—200,000例嬰兒死亡。妊娠期間被蟲體感染紅細胞(Parasitized red blood cells,PRBC)在胎盤的大量聚集是導致該病發(fā)病的主要原因。這一聚集現(xiàn)象是由一種獨特的惡性瘧原蟲紅細胞表面抗原1(Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1,PfEMP1)與胎盤受體(Chondroitin sulfate A ,CSA)的粘附介導的。研究發(fā)現(xiàn),這一獨特的PfEMP1蛋白的編碼基因是var2csa,屬于var基因家族成員。VAR2CSA是一個350kDa的高分子量蛋白質包含有六個DBL區(qū)。高水平的抗VAR2CSA抗體與PAM的保護性免疫有關。至此,基于VAR2CSA用于疫苗的研究,來保護瘧疾流行地區(qū)的孕婦是可行的。但在目前的技術條件下表達如此之大的一個蛋白質是十分困難的。因此,十分有必要鑒定出哪一個DBL區(qū)在粘附過程中發(fā)揮主要作用?以及人體對哪一個功能區(qū)的免疫應答反應在抗病免疫上起到關鍵作用?本實驗就上述存在的問題進行研究,克隆、表達了六個DBL區(qū)重組蛋白質,利用酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA),將得到的重組蛋白質進行粘附實驗和免疫識別實驗,對不同DBL區(qū)同CSA的親和能力差異與免疫差異進行了研究。 根據(jù)不同DBL區(qū)的序列設計6對引物,利用PCR技術擴增惡性瘧原蟲海南株基因組DNA中的六個目的片段,將擴增產(chǎn)物與pMD18-T克隆載體連接。經(jīng)PCR、酶切、測序鑒定正確后克隆至表達載體pET-22b上,轉化至大腸埃希菌BL21 ( DE3 ),以異丙基β-D-硫代半乳糖苷( Isopropyithionβ-D-thiogalactoside,IPTG)誘導表達重組蛋白,并用親和層析方法純化蛋白。經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulf polyacrylamidegel electrophoresis,SDS-PAGE)和蛋白質印跡(Western blot)檢測目的蛋白。結果顯示不同組氨酸標簽DBL區(qū)重組蛋白質分子質量與理論值相符。蛋白質印跡檢測結果顯示目的蛋白質具有反應原性。 利用ELISA方法對六個重組蛋白質與CSA的粘附能力進行檢測。用CSA包被ELISA板,四度過夜。將板洗滌三次后,加入3%的牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)進行封閉,37℃孵育1h。此后洗板三次,加入梯度稀釋的重組蛋白質并在37℃孵育1h。洗板三次,加入5000倍稀釋的鼠抗組氨酸標簽抗體,37℃孵育1h。洗滌三次,加入20000倍稀釋的堿性磷酸酶標記的羊抗鼠抗體,37℃孵育1h。洗滌三次,加入顯色劑顯色30分鐘,最后測定OD405值。結果顯示在任何濃度條件下,DBL5區(qū)的OD405都高于其他重組蛋白質,并且達到陰性對照的Sj23的2.1倍。且所有DBL區(qū)重組蛋白質的OD405均高于Sj23。這表明,盡管所有DBL區(qū)都能與CSA發(fā)生粘附,但DBL5區(qū)與CSA的粘附能力更強。 運用ELISA方法進行不同DBL區(qū)的免疫識別實驗。實驗方法與粘附實驗大致相同,但是包被物為重組蛋白質,且用妊娠相關瘧疾病人血清和抗人IgG抗體替換了上述實驗的重組蛋白和羊抗鼠抗體,并且沒有加入抗組氨酸標簽抗體。結果經(jīng)SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件處理,結果發(fā)現(xiàn),不同DBL區(qū)重組蛋白質間P=0.000,P0.01,不同DBL區(qū)重組蛋白質對PAM病人血清中抗體識別的差異影響具有顯著意義。其中以DBL5區(qū)OD405均值最高,Sj23 OD405均值最低。這表明在PAM抗病免疫過程中,人體對DBL5區(qū)的免疫應答可能發(fā)揮著關鍵作用。 這一研究結果不僅對基于VAR2CSA的PAM疫苗研發(fā)奠定了重要理論基礎,而且對于其他基于PfEMP1蛋白質家族的疫苗研發(fā)也具有一定意義。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R382.31

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9 陳f，

本文編號：2426306