發(fā)布時間：2019-02-15 14:27

【摘要】：剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）是人畜共患細胞內(nèi)寄生原蟲。免疫功能正常的機體感染弓形蟲，絕大多數(shù)表現(xiàn)為隱性感染，但孕婦、嬰幼兒和免疫抑制者感染后，則分別可能導(dǎo)致流產(chǎn)、畸胎或急性獲得性弓形蟲病，死亡率甚高，危害嚴(yán)重。弓形蟲蟲體侵入宿主細胞后，在細胞內(nèi)大量繁殖，排泄分泌大量抗原性物質(zhì)，即弓形蟲ESA（excreted-secreted antigens），參與引起宿主損傷和免疫反應(yīng)。 作為一種重要的機會性致病原蟲，弓形蟲的致病作用與蟲株毒力、宿主免疫狀態(tài)密切相關(guān)。據(jù)侵襲力、繁殖速度、致死率、包囊形成與否等的不同，剛地弓形蟲可分為強毒株系和弱毒株系。強毒株以RH株為代表，對常用的實驗動物小鼠都極為敏感，感染后速殖子在體內(nèi)可迅速增殖，引起急性的致死性感染，3-5天即死亡。弱毒株P(guān)RU株則為成囊株，感染包囊后的小鼠平均在一周后發(fā)病，數(shù)周后才出現(xiàn)死亡或形成長期慢性感染。 弓形蟲感染宿主后的結(jié)果取決于宿主與蟲體間的相互作用。宿主方面，，細胞免疫一直被認為是機體抵抗弓形蟲感染保護性免疫的基礎(chǔ)，在抑制蟲體繁殖、清除蟲體、控制蟲血癥方面起重要作用。近年來，隨著一群具有抑制功能的CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細胞的發(fā)現(xiàn)與深入研究，越來越多的證據(jù)表明此群細胞在調(diào)節(jié)病原體感染免疫中起重要作用，研究發(fā)現(xiàn)它們可以在一定程度上通過影響感染部位免疫應(yīng)答的敏感性來抑制過度的免疫應(yīng)答，從而導(dǎo)致病原體的長期存在。 本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，弓形蟲RH株ESA腹腔接種孕鼠，同樣可以導(dǎo)致孕鼠流產(chǎn)，引起體內(nèi)NK細胞數(shù)量上升及CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量下降。研究表明，ESA對機體所產(chǎn)生的影響與弓形蟲感染所致的影響相似。然而目前為止有關(guān)這些蟲源性物質(zhì)對機體免疫細胞的影響，研究還不深入。那么不同毒力株弓形蟲ESA對正常機體的免疫細胞影響是否會有不同？這些免疫細胞的狀態(tài)是否與不同毒力株感染后的結(jié)局有關(guān)聯(lián)？結(jié)合上述資料和問題，本研究旨在探討不同毒力株弓形蟲ESA對小鼠免疫細胞亞群的影響，觀察不同毒力株ESA對正常小鼠體內(nèi)NK細胞、CD4~+CD25~+T細胞的影響，并初步探討其變化機制，為今后弓形蟲病的免疫預(yù)防和干預(yù)提供理論基礎(chǔ)。 我們建立弓形蟲不同毒力株ESA處理小鼠模型，流式細胞術(shù)檢測各組小鼠脾臟中NK細胞、CD4~+CD25~+T細胞數(shù)量比例變化。磁珠分選NK細胞，采用LDH法檢測NK細胞對YAC-1細胞的殺傷功能；采用RT-PCR方法檢測NK細胞中顆粒酶B表達水平。同時磁珠分選CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細胞，3H-TdR摻入細胞增殖實驗檢測不同處理組脾臟CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細胞抑制功能。采用ELISA檢測不同處理組小鼠血清IFN-γ的分泌水平等。 本研究獲得如下主要結(jié)果： 1.采用無血清體外培養(yǎng)的方法，成功制備RH株、PRU株ESA，經(jīng)BCA蛋白定量法測定，RH株ESA蛋白濃度為0.48mg/mL，PRU株ESA蛋白濃度為1.9mg/mL。為確定處理濃度，采用不同劑量RH株ESA注射小鼠，流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，不同劑量RH株ESA處理小鼠，小鼠脾臟NK細胞占脾細胞的比例與PBS對照組相比均有上升，在0.002mg的劑量下已出現(xiàn)較為明顯的上升，因此，我們采用0.002mg作為處理劑量建立小鼠模型，觀察各細胞亞群變化。 2.不同毒力株ESA接種小鼠，小鼠脾臟NK細胞數(shù)量比例增加。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，不同毒力株ESA處理小鼠，脾臟NK細胞占脾細胞的比例較PBS對照組均上升，其中注射RH株ESA上升最明顯，與PRU株差異存在統(tǒng)計學(xué)意義。 3.不同毒力株ESA接種小鼠，小鼠血清IFN-γ分泌水平升高。ELISA結(jié)果顯示，不同毒力株ESA處理，小鼠血清IFN-γ分泌顯著高于對照組水平，其中RH株處理組高于PRU株處理組。 4.不同毒力株ESA接種小鼠，小鼠脾臟CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量比例降低。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，不同毒力株ESA處理小鼠，脾臟CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T占脾細胞的比例較PBS對照組均下降，其中注射RH株ESA下降最明顯，與PRU株差異存在統(tǒng)計學(xué)意義。 5.不同毒力株ESA接種小鼠，小鼠NK細胞殺傷功能增強。磁珠分選各處理組小鼠NK細胞，LDH法檢測結(jié)果顯示， ESA處理組小鼠脾臟的NK細胞較未處理NK細胞殺傷靶細胞YAC-1細胞的功能增強，其中RH株ESA處理組殺傷能力強于PRU組。 6.不同毒力株ESA接種小鼠，小鼠CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細胞抑制功能增強。磁珠分選各處理組小鼠CD4~+CD25~+T細胞，3H-TdR摻入法細胞增殖實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在抗CD3的刺激下，ESA處理組小鼠脾臟的CD4~+CD25~+T細胞抑制CD4+CD25-T細胞增殖的能力較正常對照組明顯下降，其中RH株處理組抑制功能下降較PRU株處理組明顯。 7.磁珠分選正常小鼠NK細胞、CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細胞，體外與不同毒力株ESA共培養(yǎng)，LDH法檢測NK細胞對CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)T細胞的特異性殺傷。結(jié)果顯示，不同毒力株ESA處理的小鼠NK細胞殺傷能力較對照組有明顯的升高，三組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。RH株ESA處理組殺傷率強于PRU株處理組。 以上研究結(jié)果提示，NK細胞的數(shù)量與活性增加，CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量減少、抑制功能的增強在不同毒力株ESA致小鼠不同免疫應(yīng)答狀況中可能起到重要作用；不同毒力株ESA處理小鼠后，刺激NK細胞數(shù)量上升與功能增強的程度不同，引起CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量減少及抑制功能增強程度也不同。該結(jié)果可能部分解釋弓形蟲不同毒力株致病性的差別。
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【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 趙俊桃;陳鳳鴻;陳錫慰;吳觀陵;;CD4~+CD25~+T調(diào)節(jié)細胞參與感染弓形蟲小鼠免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)的研究[J];熱帶病與寄生蟲學(xué);2008年03期

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本文編號：2423449