【摘要】：研究背景及目的： 自然選擇法則決定了病毒進化需要不斷擴展其入侵的宿主范圍。病毒基因組的高變性使得越來越多的遠緣病毒進化到感染人體并引發(fā)很多致死性傳染病的暴發(fā)流行。源于野生動物的的HIV、SARS病毒、禽流感病毒在人類的暴發(fā)與流行,從側面反應了這一現狀。T病毒,這種更遠緣的病毒會不會進化到不識別特異性受體而直接入侵人類細胞?為了提前預知這種病毒的核酸是否可以在人體內會產生生物學效應,本研究旨在觀查并分析T病毒RNA進入Hela細胞后的復制情況,以及其是否能夠誘導Hela細胞發(fā)生凋亡,并進一步推斷細胞發(fā)生凋亡的作用途徑是否與細胞內天然免疫反應密切相關。 研究內容及方法： 第一部分,將T病毒RNA借助脂質體轉染入人類Hela細胞后,主要從蛋白、mRNA表達、形態(tài)學三方面驗證T病毒RNA在Hela細胞內的復制情況,包括：1) Western blotting檢測T病毒蛋白的表達；2)RT-RCR及實時定量PCR檢測T病毒基因組正負鏈的合成；3)Northern blotting檢測T病毒基因組和亞基因組的存在；4)通過電鏡(細胞切片、負染色及免疫膠體金染色)證明T病毒子代病毒顆粒在Hela細胞內的存在；5) RT-RCR、Western blotting、電鏡(細胞切片、免疫膠體金染色)檢測病毒在細胞間及病毒從細胞到植物或裸鼠體內的傳代表達情況。 第二部分,采用IF-RNA-FISH技術對T病毒基因組和蛋白進行細胞內定位；同時采用活細胞動態(tài)成像技術示蹤T病毒RNA在Hela細胞內的運動軌跡。 第三部分,本小組前期研究推斷T病毒RNA導入后可能通過內質網應激反應(Endoplasmic reticulum stress, ERS)誘導Hela細胞發(fā)生自噬(Autophagy)。自噬作為天然免疫防御機制之一,在抗感染晚期促進細胞凋亡。因此,本部分通過Anecin V-PI染色流式對Hela細胞的凋亡情況進行檢測。為了分析凋亡的相關作用途徑,首先采用Western blotting及流式細胞術檢測自噬基因LC3的表達,確認自噬的發(fā)生；然后采用RT-RCR及Western blotting檢測GRP78在內質網上的表達,確認內質網應激的發(fā)生；最后借助電鏡及活細胞動態(tài)成像技術觀察并分析T病毒核酸、蛋白與內質網應激(ERS)及自噬(Autophagy)間的相互作用關系。 研究結果： 1.T病毒RNA導入Hela細胞后不僅合成了自身核酸、蛋白,組裝出了T病毒子代病毒顆粒,而且還可以在Hela細胞間以及從Hela細胞到T病毒宿主或裸鼠體內傳代表達,說明其在Hela細胞內發(fā)生了復制,且具有很高的生物學活性。 2.IF-RNA-FISH結果顯示：隨轉染時間的延長,T病毒部分核酸逐漸從細胞質聚集于細胞核核仁；T病毒蛋白(CP)始終定位于細胞質中�；罴毎麆討B(tài)成像也顯示了T病毒RNA從內質網(ER)到細胞核的運動軌跡。 3.流式檢測結果顯示：T病毒RNA導入后Hela細胞發(fā)生了凋亡。除確認自噬發(fā)生(自噬基因LC3蛋白的轉化、高表達；電鏡下出現典型的自噬體及自噬溶酶體、自噬空泡數量顯著增多)及內質網應激發(fā)生(GRP78在內質網上的高表達)外,免疫電鏡結果顯示：部分T病毒蛋白出現在內質網、自噬體膜及核膜附近,且隨時間延長聚集于自噬體膜表面,同時電鏡結果提示自噬體膜可能來源于內質網膜,推測內質網應激后,內質網膜擴張導致自噬前體形成,T病毒蛋白隨內質網擴張部分進入自噬體,或被自噬機制降解或利用自噬存活；雙光子共聚焦顯微鏡結果顯示T病毒RNA與一些GFP-LC3標記的自噬小體共定位于內質網,且活細胞動態(tài)成像結果呈現了T病毒RNA從進入細胞到與自噬體融合的運動軌跡,這一過程發(fā)生在內質網上,推斷T病毒RNA的復制行為導致內質網應激,進而引發(fā)細胞自噬,自噬后期誘導細胞發(fā)生凋亡。 研究意義： 病毒的進化和人類的探索活動拉近了人與不同物種間的距離,跨生物界生命物質比以往任何時候都更容易發(fā)生交叉與融和。病毒本身的高度變異,使得病毒能否入侵人體細胞,已經不完全決定于特異性受體的有無。該課題瞄準跨生物界遠緣病毒入侵這一空白研究領域,以對人類無特異性受體、無主動侵襲性的T病毒和人類宮頸癌Hela細胞系為模型,首次對T病毒對非宿主細胞的作用機制進行了較為系統(tǒng)和深入的研究,突破原有的病毒相關細胞膜受體研究思路,從一個全新的角度探索病毒預防的策略。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392

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本文編號：2420497