【摘要】：目的：對融合蛋白d-EGF二級、三級結(jié)構進行預測并分析其活性部位的可能影響，進行原核表達，并對表達產(chǎn)物進行分析鑒定。方法：以融合蛋白質(zhì)基因序列為基礎，用DNAStar軟件預測其蛋白質(zhì)的二級結(jié)構；用Insight II軟件對其三級結(jié)構進行建模預測。在對融合蛋白理論預測的基礎上，分別構建含β-defensin-3、EGF的重組質(zhì)粒，應用重組PCR等方法，將EGF的基因序列融合到β-defensin-3DNA序列的3’末端，將融合基因克隆入原核表達載體pET-SUMO,構建目的重組質(zhì)粒pET-SUMO-d-EGF。采用PCR、測序等方法對目的基因是否正確重組進行鑒定；以重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21（DE3），以IPTG誘導表達目的蛋白質(zhì)，，表達產(chǎn)物經(jīng)過Ni-trap柱純化，SDS-PAGE檢測表達初產(chǎn)物及純化產(chǎn)物。最后用Western-blot對其特異性進行鑒定；用MTT法檢測其促細胞增殖活性；用紙片擴散法藥物敏感試驗、微量稀釋法檢測其抗菌活性。結(jié)果：采用DNAStar軟件的Gamier Robson方法預測的結(jié)果表明，融合蛋白質(zhì)d-EGF含較多的β折疊結(jié)構；Charge Density-Charge法預測蛋白質(zhì)3-22、31-48區(qū)段帶豐富的正電荷；Insight II軟件分析顯示重組蛋白d-EGF中原蛋白β-defensin-3、EGF三級結(jié)構中的活性必須的六個鏈內(nèi)二硫鍵在融合蛋白中都能夠正確形成，維持β-defensin-3三級結(jié)構的3個反向平行的β折疊片結(jié)構在融合蛋白中能夠形成。融合蛋白的結(jié)構含有原蛋白β-defensin-3、EGF的生物活性結(jié)構。成功構建β-defensin-3、EGF重組質(zhì)粒，經(jīng)重組PCR成功擴增出294bp的目的片段，重組體PCR結(jié)果與預期結(jié)果一致，測序正確。轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的E.coli BL21（DE3）經(jīng)IPTG誘導、SDS-PAGE分析得到28kD左右的目的蛋白條帶。用Western-blot鑒定出融合蛋白含有EGF，β-防御素-3的相應蛋白抗原表位。用MTT法測得融合蛋白d-EGF EC50約為0.4ng/ml,與EGF標準品EC500.08-0.8ng/ml相符；用紙片擴散法藥物敏感實驗檢測對金黃色葡萄球菌有明顯抑菌環(huán)出現(xiàn)，抑菌濃度25μg/ml相對標準品h β-defensin-3的MIC12.5μg/ml，說明d-EGF抑菌活性比標準品相對弱一些。 結(jié)論：在預測融合蛋白d-EGF的二、三級結(jié)構的基礎上，成功構建原核表達載體pET-SUMO d-EGF,并表達出純化的融合蛋白，且融合蛋白d-EGF具有促細胞增殖和抗菌活性。
[Abstract]:Aim: to predict the secondary and tertiary structure of the fusion protein d-EGF and analyze the possible effects of its active site on prokaryotic expression. Methods: based on the fusion protein gene sequence, the secondary structure of its protein was predicted by DNAStar software, and its tertiary structure was modeled and predicted by Insight II software. Based on the prediction of fusion protein theory, the recombinant plasmids containing 尾-defensin-3,EGF were constructed, and the gene sequence of EGF was fused to the 3 'terminal of 尾-defensin-3DNA by means of recombinant PCR. Construction of Recombinant plasmid pET-SUMO-d-EGF. by cloning Fusion Gene into prokaryotic expression Vector pET-SUMO, PCR, sequencing was used to identify the correct recombination of the target gene. The recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli E.coli BL21 (DE3), and the target protein was induced by IPTG. The expressed product was purified by Ni-trap column, and the expressed product and purified product were detected by SDS-PAGE. Finally, its specificity was identified by Western-blot, the cell proliferation activity was detected by MTT assay, the drug sensitivity test by disk diffusion method and the antimicrobial activity by microdilution method. Results: the results of Gamier Robson method using DNAStar software showed that the fusion protein d-EGF contained more 尾 -fold structure, and the Charge Density-Charge method was used to predict the rich positive charge in protein 3-22N 31-48 region. The analysis of Insight II software showed that the disulfide bonds in the six chains necessary for the activity of the proto-protein 尾-defensin-3,EGF in the recombinant protein d-EGF could be formed correctly in the fusion protein. Three reverse parallel 尾-fold structures that maintain the tertiary structure of 尾-defensin-3 can be formed in the fusion protein. The structure of the fusion protein contains the bioactive structure of proto-protein 尾-defensin-3,EGF. The recombinant plasmid of 尾-defensin-3,EGF was successfully constructed and the target fragment of 294bp was successfully amplified by recombinant PCR. The result of PCR was consistent with the expected result and the sequencing was correct. E.coli BL21 (DE3) transformed into the recombinant plasmid was induced by IPTG, and the target protein bands about 28kD were obtained by SDS-PAGE analysis. The corresponding protein epitopes containing EGF, 尾-defensin-3 were identified by Western-blot. The fusion protein d-EGF EC50 measured by MTT method was about 0.4 ng / ml, which was consistent with EGF standard EC500.08-0.8ng/ml. The antimicrobial activity of d-EGF was weaker than that of standard h 尾-defensin-3, and the inhibitory concentration of 25 渭 g/ml was relative to MIC12.5 渭 g / ml of h 尾-defensin-3. Conclusion: on the basis of predicting the secondary and tertiary structure of d-EGF, the prokaryotic expression vector pET-SUMO d-EGF was successfully constructed, and the purified fusion protein was expressed. The fusion protein d-EGF has the ability of promoting cell proliferation and antibacterial activity.
【學位授予單位】：蚌埠醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R341

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