【摘要】：研究背景： 肝衰竭具有病情危重、預后差、病死率極高、治療難度大的特點。人工肝支持療法已被證實是一種能夠暫時替代患肝的部分功能,為其肝細胞再生爭取時間,使患者得以過渡到自體肝功能恢復或肝移植的有效手段。人工肝支持療法自上世紀50年代始,從非生物型發(fā)展至今,已經進入到生物型、混合型的攻堅階段。 生物型/混合型人工肝得以起效,需要極大量(大于5×109)的具有良好活性和肝細胞功能的細胞。選擇適合用于人工肝支持系統的細胞源,是生物型/混合型人工肝的研究熱點和難點之一。目前國際上研究較多的細胞源包括：成熟的人肝或豬肝細胞、人肝腫瘤的細胞系(如C3A等)、胎肝細胞、永生化肝細胞株(如本實驗室構建的HepLL、HepLi4),以及各種類型的干細胞。雖然細胞材料繁多,但目前尚無一種細胞源能完全滿足生物人工肝應用的需要。 肝祖細胞是肝臟來源的干細胞,同時具有肝細胞與膽管細胞的表型,自我復制能力強,有向肝細胞和膽管上皮細胞雙向分化的潛能,且在發(fā)育學上與肝外來源的干細胞相比,具有更接近成熟肝細胞和膽管細胞的優(yōu)勢。因此,這類細胞被認為是一種很有前景的用于肝病治療的細胞源。但是,肝祖細胞要作為生物人工肝的細胞源應用于臨床,還有許多問題亟須解決。其中,進一步明確影響肝祖細胞增殖和分化的因素,建立起安全高效的體外培養(yǎng)和誘導分化體系,是肝祖細胞得以更深入研究和廣泛應用的前提和基礎。 第一部分膠原蛋白應用于肝祖細胞的無血清培養(yǎng)的研究 目的：本研究旨在應用膠原蛋白披覆的平板和無血清培養(yǎng)基相結合的方法優(yōu)化肝祖細胞的無血清培養(yǎng),以建立更安全的肝祖細胞體外培養(yǎng)體系。 方法：以源自TAT啟動子-lacZ轉基因小鼠的具有雙向分化潛能的肝祖細胞系BMEL-TAT為肝祖細胞模型,以不同種類膠原蛋白披覆的常規(guī)細胞培養(yǎng)平板和一種無血清培養(yǎng)基相結合的方式,連續(xù)培養(yǎng)肝祖細胞14天。選用的膠原蛋白包括Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅰ型和Ⅲ型的混合(質量比1：1),以及Ⅳ型膠原蛋白。以無膠原披覆的細胞培養(yǎng)板結合同種無血清培養(yǎng)基,或結合添加了5%胎牛血清的同種培養(yǎng)基組,分別作為實驗的陰性對照和陽性對照。動態(tài)觀測BMEL-TAT細胞在不同條件下的形態(tài)(倒置相差顯微鏡)、貼壁、增殖(血細胞計數板法、Cellscreen法)和向肝細胞方向自分化(X-gal染色、MUG檢測)的程度。 結果：BMEL-TAT細胞在所測試的膠原蛋白披覆的培養(yǎng)板上無血清培養(yǎng)時,均呈單層貼壁生長,與含血清培養(yǎng)組的生長模式相似,但其在無膠原的培養(yǎng)板上無血清培養(yǎng)時,呈聚集生長模式。在所測試的膠原蛋白披覆的培養(yǎng)板上無血清培養(yǎng)時BMEL-TAT的貼壁速率、效率和增殖速率均高于普通培養(yǎng)板無血清組,其增殖速率與含血清培養(yǎng)組無顯著性統計學差異。X-gal染色和MUG檢測的結果基本一致,均提示在各種膠原蛋白披覆的培養(yǎng)板上無血清培養(yǎng)的BMEL-TAT顯示出與含血清培養(yǎng)組相當的向肝細胞方向的自分化水平,但其自分化水平低于在普通培養(yǎng)板上無血清培養(yǎng)的BMEL-TAT自分化水平。膠原蛋白Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅰ型和Ⅲ型的混合,以及Ⅳ型能等效地促進BMEL-TAT細胞的貼壁和增殖,對其生長模式和向肝細胞自分化的影響亦相當。 結論：選用膠原蛋白Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅰ型和Ⅲ型的混合(質量比1：1),以及Ⅳ型中的任何一種披覆細胞培養(yǎng)板,均能使BMEL-TAT細胞在無血清培養(yǎng)基中實現與常規(guī)含5%胎牛血清培養(yǎng)等效的生長、增殖和向肝細胞自分化的水平。 第二部分海藻酸-殼聚糖微囊包裹法應用于肝祖細胞向肝細胞方向誘導分化的研究 目的：本研究旨在評價海藻酸-殼聚糖微囊包裹技術應用于肝祖細胞向肝細胞方向誘導分化的可行性和有效性,以建立高效的便于放大規(guī)模的誘導分化體系,為肝祖細胞進一步應用于微囊相關的生物反應器為核心的生物人工肝提供基礎數據。 方法：以源自TAT啟動子-lacZ轉基因小鼠的具有雙向分化潛能的肝祖細胞系BMEL-TAT為細胞模型,以海藻酸-殼聚糖微囊包裹5×106/ml和2×106/ml兩種BMEL-TAT細胞密度。微囊包裹后在生長培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)21天,動態(tài)觀測微囊內細胞的形態(tài)(倒置光學顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡)、活力(FDA/PI雙染色)和增殖(血細胞計數板計數),以及微囊的機械強度�；蚴俏⒛野笙扔蒙L培養(yǎng)基培養(yǎng)3天后,再換誘導分化培養(yǎng)基連續(xù)誘導15天,動態(tài)觀測細胞的形態(tài)(倒置光學顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡)、活力(FDA/PI雙染色)和向肝細胞方向分化的程度(熒光定量PCR檢測ALB、TAT、CK19和GGT IV基因的表達,尿素合成功能檢測)。誘導分化實驗以單層貼壁的BMEL-TAT作為對照。 結果：兩微囊組在生長培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)21天的過程中,包裹BMEL-TAT的海藻酸-殼聚糖微囊具有良好的機械性能,微囊內BMEL-TAT細胞漸呈聚集生長趨勢,細胞聚集體形成的時間、數目和大小與包裹的細胞密度密切相關。微囊內細胞具有良好活力,但增殖不明顯。 兩微囊組在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天后,換誘導分化培養(yǎng)基連續(xù)誘導15天的過程中,海藻酸-殼聚糖微囊內BMEL-TAT細胞呈聚集生長趨勢,具有良好活力。熒光定量PCR結果顯示海藻酸-殼聚糖微囊包裹的細胞密度高(5×106/ml)時,BMEL-TAT顯示出更好的向肝細胞的分化。細胞包裹密度5×106/ml的海藻酸殼聚糖微囊組與單層貼壁組相比,BMEL-TAT細胞中成熟肝細胞相關基因(ALB、TAT)的上調,以及肝祖細胞和膽管上皮細胞相關基因(CK19)的下調均更顯著(P0.05)。兩微囊組BMEL-TAT細胞的尿素合成量均在誘導前5天緩慢上升,而后迅速上升至誘導第10天出現高峰,隨后有所回落。5×106/ml細胞密度微囊組BMEL-TAT的尿素合成量高于2×106/ml細胞密度微囊組,而2×106/ml細胞密度微囊組又高于單層貼壁組,其中5×106/ml密度微囊組的尿素合成高峰值是單層貼壁組高峰值的2.44倍,且差異具有統計學意義(P0.05)。熒光定量PCR和尿素合成檢測的結果均提示細胞包裹密度5×106/ml的海藻酸-殼聚糖微囊能顯著促進BMEL-TAT向肝細胞方向的分化。 結論：海藻酸-殼聚糖微囊包裹能促進BMEL-TAT細胞向肝細胞方向的誘導分化,微囊包裹的細胞密度以5×106/ml為宜。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R329

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本文編號：2405215