【摘要】：樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)與NK細(xì)胞之間的相互作用對(duì)體內(nèi)天然免疫和獲得性免疫功能均有重要影響。前期研究發(fā)現(xiàn),DC細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)MHCI類相關(guān)抗原A (MICA)后具有激活NK細(xì)胞的活性,而MICA在腫瘤細(xì)胞和正常上皮細(xì)胞的持續(xù)表達(dá)卻下調(diào)NK細(xì)胞活性。因此,為觀察DC細(xì)胞體內(nèi)持續(xù)表達(dá)MICA對(duì)NK細(xì)胞功能的影響,課題組前期制備了以小鼠CD86基因啟動(dòng)子調(diào)控視黃酸早期轉(zhuǎn)錄蛋白-1(retinoic acid early transcript-1, RAE-1)的轉(zhuǎn)基因小鼠(RAE-1是MICA在小鼠體內(nèi)對(duì)應(yīng)分子)。本研究則主要分析pCD86-RAE-1ε轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)NK細(xì)胞的活性,從而深入闡明DC持續(xù)表達(dá)NKG2D配體對(duì)NK細(xì)胞功能的影響。 一、體外分析pCD86-RAE-1ε轉(zhuǎn)基因小鼠NK細(xì)胞的活性 目的：比較生理狀態(tài)下及聚肌胞刺激后,pCD86-RAE-1ε轉(zhuǎn)基因小鼠與對(duì)照小鼠脾臟單細(xì)胞懸液內(nèi)NK細(xì)胞殺傷活性及相關(guān)表型的差異。 方法：首先,分離pCD86-RAE-1ε轉(zhuǎn)基因小鼠與對(duì)照小鼠脾臟單細(xì)胞懸液,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NK細(xì)胞頻率,NK細(xì)胞殺傷YAC細(xì)胞活性,以及細(xì)胞表面NKG2D、CD69、 NKp46和2B4的表達(dá)。并用LDH釋放法鑒定NK細(xì)胞對(duì)YAC細(xì)胞的殺傷活性。其次,對(duì)脾臟單細(xì)胞懸液用聚肌胞刺激過(guò)夜,基于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NK細(xì)胞殺傷YAC細(xì)胞的性,以及NK細(xì)胞表面NKG2D、CD69、NKp46和2B4的表達(dá),同時(shí)用LDH釋放法檢測(cè)NK細(xì)胞殺傷YAC細(xì)胞的活性。 結(jié)果：與對(duì)照小鼠相比,pCD86-RAE-1ε轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟內(nèi)NK細(xì)胞的頻率沒(méi)有明顯差異。生理狀態(tài)下,轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性與對(duì)照小鼠無(wú)差異。轉(zhuǎn)基因鼠脾臟NK細(xì)胞NKG2D和2B4表達(dá)下調(diào),CD69表達(dá)上調(diào),但NKp46表達(dá)無(wú)明顯變化。聚肌胞刺激后,轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟NK細(xì)胞的殺傷活性明顯增高,NKG2D和CD69的表達(dá)顯著上調(diào),而NKp46和2B4的表達(dá)在轉(zhuǎn)基因小鼠和對(duì)照小鼠脾臟NK細(xì)胞均下調(diào)。 結(jié)論：抗原遞呈細(xì)胞持續(xù)表達(dá)RAE-1ε可下調(diào)體內(nèi)NK細(xì)胞表面NKG2D的表達(dá),但對(duì)NK細(xì)胞殺傷活性無(wú)明顯影響。受聚肌胞刺激,pCD86-RAE-1ε轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟NK細(xì)胞活性顯著提高。 二、體內(nèi)分析pCD86-RAE-1ε轉(zhuǎn)基因小鼠NK細(xì)胞的活性 目的：體內(nèi)分析轉(zhuǎn)基因小鼠NK細(xì)胞殺傷不同RAE-1表達(dá)水平靶細(xì)胞的活性。 方法：首先利用LDH釋放法,觀察經(jīng)IL-2刺激的小鼠NK細(xì)胞殺傷轉(zhuǎn)基因小鼠和對(duì)照小鼠脾臟單細(xì)胞懸液活性,以及該殺傷活性是否主要依賴于脾臟B細(xì)胞表面RAE-1表達(dá)。其次將聚肌胞分別腹腔注射轉(zhuǎn)基因小鼠與對(duì)照小鼠,次日分離脾臟單細(xì)胞懸液,流式細(xì)胞術(shù)分析NK細(xì)胞殺傷活性、及NKG2D和CD69的表達(dá)。最后分別用CFSE和PKH26標(biāo)記轉(zhuǎn)基因鼠和對(duì)照小鼠脾臟細(xì)胞,等比例混合,尾靜脈分別注射至正常狀態(tài)、或經(jīng)聚肌胞刺激的轉(zhuǎn)基因鼠和對(duì)照小鼠,14小時(shí)后取脾臟制備單細(xì)胞懸液,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩種不同標(biāo)記細(xì)胞的比例變化以評(píng)估體內(nèi)NK細(xì)胞殺傷率。 結(jié)果：生理狀態(tài)下,pCD86-RAE-1ε轉(zhuǎn)基因小鼠與對(duì)照小鼠體內(nèi)NK細(xì)胞殺傷活性無(wú)明顯差異。但聚肌胞刺激后,轉(zhuǎn)基因小鼠NK細(xì)胞殺傷活性、CD69陽(yáng)性NK細(xì)胞頻率均高于對(duì)照小鼠組,而NKG2D陽(yáng)性NK細(xì)胞頻率仍低于對(duì)照小鼠。同時(shí)轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)NK細(xì)胞的殺傷活性明顯高于對(duì)照小鼠。 結(jié)論：抗原遞呈細(xì)胞持續(xù)表達(dá)RAE-1對(duì)NK細(xì)胞活性的影響與腫瘤細(xì)胞、正常上皮細(xì)胞持續(xù)表達(dá)RAE-1對(duì)NK細(xì)胞的影響不同,提示盡管NKG2D配體在不同細(xì)胞表面的持續(xù)表達(dá)均下調(diào)NK細(xì)胞表達(dá)NKG2D,對(duì)NK細(xì)胞的活性卻具有不同的影響。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R392.12

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本文編號(hào)：2398436