發(fā)布時間：2018-12-18 05:18

【摘要】：目的：研究慢病毒介導人端粒酶逆轉錄酶(h-TERT)基因對人張氏肝細胞(chang liver)生物學特性的影響。 方法：將表達h-TERT基因的重組慢病毒感染人肝細胞,通過殺稻瘟篩選獲得陽性克隆。采用實時熒光RT-PCR方法檢測轉染前后chang liver肝細胞的h-TERT-mRNA基因表達水平和運用TRAP-PCR法擴增端粒重復序列以及ELISA檢測轉染前后chang liver肝細胞的端粒酶活性的變化。通過倒置相差顯微鏡動態(tài)觀察轉染前后肝細胞形態(tài)變化及生長增殖情況。通過MTT法觀察轉染前后細胞增長變化,運用流式細胞術(FCM)檢測轉染前后細胞周期。通過全自動生化分析儀測定轉染前后細胞培養(yǎng)上清中ALB含量以及用RT-PCR方法檢測轉染前后細胞培養(yǎng)上清中ALB mRNA的表達。采用過碘酸希夫(periodic acid schiff, PAS)實驗進行轉染前后細胞糖原染色。 結果：轉染后的chang liver肝細胞存在h-TERT基因過表達和端粒酶活性上調。形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)h-TERT-chang liver均呈橢圓形、紡錘形或多角形,上皮樣細胞貼壁生長,與轉染前細胞相比無明顯差異。細胞生長曲線發(fā)現(xiàn)h-TERT-chang liver較chang liver生長速度明顯提高,進一步檢測細胞周期觀察到其G1期細胞數(shù)下降,G2/M期和S期的細胞數(shù)升高,P I升高,提示h-TERT-chang liver較chang liver增殖能力較強。培養(yǎng)上清生化指標結果表明轉染后的肝細胞仍然保持了轉染前肝細胞的合成分泌ALB功能,轉染前后細胞PAS染色結果表明,轉染后的肝細胞仍然保持轉染前肝細胞的糖原合成功能。 結論：利用h-TERT基因構建的h-TERT-chang liver肝細胞在體外培養(yǎng)條件下基本維持肝細胞原有形態(tài),存活期顯著延長,增殖能力較強；并且具有表達和分泌ALB及合成糖原的功能；為生物人工肝在臨床的廣泛應用提供了廉價易得且安全可靠的肝細胞源,為肝細胞移植和體外藥物篩選建立了新的實驗基礎和生物學模型。
[Abstract]:Aim: to study the effect of human telomerase reverse transcriptase (h-TERT) gene mediated by lentivirus on the biological characteristics of human (chang liver) in Zhang's hepatocytes. Methods: the recombinant lentivirus expressing h-TERT gene was infected with human hepatocytes and positive clones were obtained by killing rice blast. The expression level of h-TERT-mRNA gene in chang liver hepatocytes before and after transfection was detected by real-time fluorescence RT-PCR, telomere repeat sequence was amplified by TRAP-PCR method, and telomerase activity of chang liver hepatocytes before and after transfection was detected by ELISA. The morphological changes and proliferation of hepatocytes before and after transfection were observed by inverted phase contrast microscope. Cell growth before and after transfection was observed by MTT, and cell cycle was detected by flow cytometry (FCM) before and after transfection. The content of ALB in supernatant of cell culture before and after transfection and the expression of ALB mRNA in supernatant of cell culture before and after transfection were detected by automatic biochemical analyzer and RT-PCR method. Cell glycogen staining was performed before and after transfection by (periodic acid schiff, PAS) assay. Results: overexpression of h-TERT gene and up-regulation of telomerase activity were observed in chang liver hepatocytes after transfection. Morphological observation showed that h-TERT-chang liver were oval-shaped, fusiform or polygonal, epithelioid cells were adherent to the wall, and there was no significant difference between the cells before transfection and those before transfection. The cell growth curve showed that the growth rate of h-TERT-chang liver was significantly higher than that of chang liver. Further cell cycle analysis showed that the number of cells in G1 phase decreased, and the number of cells in G 2 / M phase and S phase increased in G 2 / M phase and S phase. The results suggest that h-TERT-chang liver has stronger proliferative ability than chang liver. The biochemical index of culture supernatant showed that the hepatocytes still maintained the function of synthesis and secretion of ALB before and after transfection, and the PAS staining showed that before and after transfection. After transfection, the hepatocytes maintained the function of glycogen synthesis before transfection. Conclusion: the h-TERT-chang liver hepatocytes constructed by h-TERT gene have the function of expressing and secreting ALB and synthesizing glycogen. It provides a cheap, safe and reliable source of hepatocytes for the wide application of bioartificial liver in clinic, and establishes a new experimental basis and biological model for hepatocyte transplantation and drug screening in vitro.
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R329

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